1.
Organización y funciones de los componentes del espacio extracelular.
El corazón es un órgano único. Su funcionamiento
como motor del sistema circulatorio tiene sus pilares en una estructura tisular
especialmente adaptada para satisfacer las demandas de actividad durante etapas
de reposo y ejercicio. Sin embargo, ninguno de los procesos que ocurren durante
la contracción cardiaca puede ser completamente comprendido sin tener en cuenta
el papel de la MEC. Esta estructura tridimensional sirve como esqueleto para
todas las células contenidas en el miocardio pero, lejos actuar como mero
andamio, sus funciones a muchos otros niveles hacen posible un amplio abanico
de procesos cardiacos. Al actuar como base de anclaje para los componentes celulares
del miocardio y nexo de comunicación entre estos, la MEC integra en cada
excitación el aporte de cada célula individual, permitiendo la contracción
coordinada y conjunta del tejido a nivel macroscópico. El entorno
tridimensional que aporta al miocardio (en conjunto referido como espacio
extracelular) hace posible la distribución de una gran variedad de proteínas y
otras moléculas solubles relacionadas con multitud de procesos. Además,
diversos componentes de la MEC sirven como lugares específicos de anclaje para
muchas de estas moléculas solubles, que ven afectadas su disponibilidad y
circulación. Otros componentes, extremadamente hidrofílicos, desarrollan un papel fundamental
acumulando agua, que aporta una excelente resistencia a la compresión. La organización,
composición y densidad de la MEC son dinámicas, no sólo en condiciones
patológicas, sino en condiciones normales. Estas tres propiedades se mantienen
en constante cambio atendiendo a eventuales demandas, y todas tienen un
importante impacto sobre la función del miocardio12.
Por todo lo expuesto, no resulta coherente estudiar
el espacio extracelular como una entidad aislada e independiente, sino que es
necesario tener en cuenta la presencia de todos aquellos elementos que pueblan
el espacio tridimensional provisto por la MEC para justificar la presencia de
ésta. Aunque funcionando como un conjunto, el espacio extracelular puede ser
dividido en tres estructuras de orden inferior. Las dos primeras, la membrana
basal y la matriz intersticial, forman parte del andamio estructural creado por
la MEC. La tercera, el fluido extracelular, aunque con una indudable
contribución a la estructura, aporta sobre todo una vía de comunicación entre
todos los elementos componentes del tejido.
La membrana basal.
La membrana basal es un complejo
proteico especializado de la MEC que subyace a todas las monocapas celulares
del organismo. Su estrecha
relación con las células es fundamental ya que provee a los tejidos de
estabilidad mecánica y también de señales que determinan la polaridad celular y
la migración. En el corazón, sus constituyentes mayoritarios a nivel proteico
son las lamininas, colágenos IV, XV y XVIII, perlecano, agrina y nidógenos 1 y
235,36,37,38.
La matriz
intersticial. La matriz intersticial es la
entidad de la MEC que contribuye en mayor medida a las propiedades mecánicas
del tejido. Aparece físicamente anclada a la membrana basal aunque forma una
unidad funcional diferente que, además de dar resistencia mecánica y soporte
estructural al miocardio, provee a este del compartimento extracelular a través
del cual se distribuyen señales y nutrientes y migran los fibroblastos. En el
corazón, sus componentes principales son los colágenos I, III, VI y XII, los
proteoglicanos y las proteínas matricelulares que aparecen asociadas a los
componentes anteriores39.
El fluido
extracelular. El fluido extracelular es el
líquido que baña a todas las estructuras celulares y extracelulares de un
tejido. Contiene elementos necesarios para el funcionamiento y viabilidad
celular tales como iones (Na+, K+, Ca2+, Cl- y HCO3-)
, glucosa y otros azúcares, aminoácidos, ácidos grasos, neurotransmisores,
hormonas y factores de crecimiento, citoquinas y otras proteínas. Estos elementos proceden de la secreción celular in situ y del plasma sanguíneo, que
permanece en continuo intercambio con el fluido extracelular mediante
filtración endotelial de los capilares. Los productos de secreción y de desecho
de las células ejercen importantes papeles en la regulación autocrina y paracrina
y son drenados hacia la circulación mediante el sistema linfático40.
2.
Componentes proteicos del espacio extracelular
El espacio extracelular está compuesto por una
amalgama de componentes de naturaleza dispar. Proteínas, azúcares y lípidos,
son componentes habituales de las diferentes entidades extracelulares ya
descritas. Las proteínas son moléculas particularmente promiscuas en la
asociación con otros componentes para dar elementos híbridos como son las
glicoproteínas, proteoglicanos o lipoproteínas, contribuyendo todos ellos de
forma definitiva al funcionamiento y mantenimiento del espacio extracelular
como conjunto. Por este motivo, resulta complicado establecer una clasificación
apropiada de los componentes proteicos de la MEC, tanto cardiaca como a nivel
general. Las clasificaciones funcionales dan lugar a grupos filogenéticamente
heterogéneos, mientras que organizaciones basadas exclusivamente en la
filogenia producen grupos complicados de explicar funcionalmente. En muchos
casos, aunque las homologías a nivel de secuencia son grandes, las
modificaciones post-traduccionales provocan importantes diferencias, habiendo
también variaciones en la distribución por tejidos.
De este modo, aunque no existe una clasificación de
los componentes de la MEC adecuada para todos los abordajes, se describirá la
que resulta más apropiada para este trabajo. De este modo, se tendrán en cuenta
cuatro grupos de proteínas de la MEC: (1) proteoglicanos, (2) colágenos (3)
glicoproteínas y (4) un grupo, más artificial, que reúne proteínas de membrana
importantes para la interacción célula-MEC. Otros componentes del espacio extracelular que por su
heterogeneidad resultan inabordables como grupo, se tomarán en cuenta en base a
los resultados.
2.1
Proteoglicanos
Aceptados como componentes estructurales
importantes de la MEC del cartílago desde principios de los años 60, los
proteoglicanos (PGs) fueron durante años considerados específicos de este
tejido. Sin embargo, en las últimas décadas se ha puesto de manifiesto su
presencia en todos los tejidos, donde aparecen distribuidos por la matriz
intersticial y la membrana basal, además de conformar receptores de membrana
importantes para la interacción célula-matriz41.
Los proteoglicanos presentan una estructura básica
compuesta por un núcleo proteico y un número variable de cadenas de
glicosaminoglicanos (GAGs) ancladas a la cadena aminoacídica en lugares
específicos. Su diversidad se basa en los genes que codifican el núcleo
proteico, el uso diferencial de exones contenidos en estos genes y la variedad
en longitud, tipo y número de cadenas de GAGs42.
El hecho de que los proteoglicanos se pierdan
durante los pasos de fijación tradicional, es quizá lo que ha provocado que
pocos estudios clásicos acerca de la MEC en condiciones sanas y patológicas
hayan prestado especial atención al contenido en proteoglicanos43. A pesar de
que el número total de proteoglicanos en mamíferos no supera la cincuentena, el
rango de pesos moleculares de los distintos núcleos proteicos varía desde los
apenas 20kDa del sindecano-4, hasta los 466 kDa del perlecano. El número de
cadenas de GAGs es extremadamente variable, y puede ir desde una única cadena
(decorina) hasta más de 100 (agrecano). Además, el contenido en GAGs es
susceptible de verse afectado cuantitativa y cualitativamente por la edad, el
ejercicio y diversas patologías44. Cuando se utilizan técnicas de identificación en las
que el peso molecular resulta una característica esencial (western blot), el número y tipo de cadenas de GAGs puede modificar
el peso aparente de forma significativa puesto que afecta tanto al peso
molecular como a la carga, y por tanto a las propiedades electroforéticas42.
2.1.a Glicosaminoglicanos
(GAGs). Los GAGs
son polisacáridos lineales largos, heterogéneos y negativamente cargados45 constituyentes
fundamentales de la matriz extracelular de todos los tejidos. Consisten en unidades
repetitivas de disacáridos compuestos por un aminoazúcar y un ácido urónico. El
aminoazúcar puede ser N-acetilgalactosamina (GalNAc) o N-acetilglucosamina
(GlcNAc), y el ácido urónico será ácido
glucourónico (GlcUA) o bien
ácido idurónico (IdoUA). Los mecanismos que
controlan la longitud de las cadenas de GAGs permanecen desconocidos46. Con la excepción del ácido hialurónico, que
además es el único GAG no sulfurilado, los GAGs aparecen normalmente unidos de
forma covalente a un núcleo proteico47.
Debido a sus cargas negativas, los GAGs en solución
acuosa aparecen rodeados por una capa de moléculas de agua ocupando un enorme
volumen hidrodinámico. Cuando la solución de GAGs es sometida a compresión, el
agua es evacuada y los GAGs reducen su volumen hasta que la presión desaparece,
recuperando su volumen original45.
Esta propiedad les permite actuar como amortiguadores naturales cuando forman
parte de un tejido conectivo, y resulta fundamental en tejidos sometidos ciclos
continuos de presión-descompresión tales como el cartílago o los músculos. Sin
embargo, las funciones los GAGs se extienden mucho más allá de un mero papel
estructural. Pueden unir citoquinas o factores de crecimiento regulando así su
distribución y disponibilidad y ejercer acciones directas de señalización
cuando son degradados. De este modo, los GAGs desarrollan una triple función
como reservorios, sumideros y cofactores de una enorme cantidad de moléculas de
señalización48 que median la
adhesión, crecimiento y diferenciación celular, controlando así eventos
asociados con la inflamación49, desarrollo neuronal50, fibrosis51, o angiogénesis52 entre otros. Por este motivo, los GAGs poseen
una importante cantidad de aplicaciones farmacéuticas como agentes
anticoagulantes, antitrombóticos y antilipémicos44.
Estructuralmente, existen
cuatro familias de GAGs: (i) condroitin
sulfato y dermatán sulfato, (ii) heparán sulfato y heparina, (iii) queratán
sulfatos I y II y (iv) ácido hialurónico53.
(i) Condroitin
sulfato (CS) y dermatán sulfato (DS). Estos dos GAGs surgen del mismo
precursor, la condroitina, con la unidad disacarídica repetitiva GalNAC(β1,4)GlcUA(β1,3)44. Esta forma inicial conforma la
estructura del CS, que se distribuye por una amplia variedad de tejidos
incluyendo corazón y cartílago54. Forma parte de proteoglicanos de la MEC como el
versicano y el agrecano55. El DS se
considera una forma modificada del CS, derivada de la epimerización de residuos
GalNAc a IdoA56. Aparece
distribuido principalmente en la piel, pero también se asocia con los proteoglicanos
biglicano57, versicano58 y decorina59, presentes en una gran variedad de
tejidos.
(ii) Heparán
sulfato (HS) y heparina. Los PGs heparán sulfato están presentes en la superficie
de todas las células humanas44. El HS es un polímero lineal de unidades repetitivas con
una composición habitual GlcAβ(1,4)GlNAcα(1,4). Ejemplos de
proteoglicanos-HS pertenecientes a la MEC son el perlecano60, la agrina61 y el colágeno
XVIII62. La heparina,
puede ser considerado una forma modificada del HS, pero su expresión es mucho
más restringida63.
(iii) Queratán
sulfato (KS). Los PGs con residuos de KS aparecen distribuidos en una gran variedad de
tejidos. La principal particularidad del KS es la presencia de galactosa en
lugar del ácido urónico en su unidad básica repetitiva. La estructura de esta
unidad es Galβ(1-4)GlcNAcβ(1,3)64. Existen dos clases fundamentales de queratán
sulfato. El KSI se une al núcleo proteico en residuos de asparragina mediante
enlace N-glicosídico. El KSII establece enlaces O-glicosílicos con residuos de
serina o treonina65. Algunos autores,
establecen incluso una tercera clase de KS en el que el enlace O-glicosílico se
establece con residuos de serina mediante una manosa intermedia66. Son PGs-KS de la matriz
extracelular el agrecano y diversos miembros de la familia SLRP64, tratados con mayor detalle en secciones posteriores.
(iv) Ácido
hialurónico. El ácido hialurónico es el
GAG no sulfurilado más abundante en la MEC. Se diferencia de los otros GAG
descritos hasta ahora porque nunca aparece unido covalentemente a un núcleo
proteico y además, su cadena de disacáridos polimeriza en el espacio
extracelular en lugar de en el aparato de Golgi. Su estructura flexible en
espiral está compuesta por hasta 10.000 repeticiones del disacárido GlcUAβ(1,3)GlcNAcβ(1,4)47.
Resulta imprescindible para el ensamblaje de la matriz de los tejidos
conectivos y la estabilización de elementos no estructurales o débilmente
fijados a la estructura de la MEC67. La gran longitud de sus cadenas, junto con
la carga aniónica de éstas, provocan la atracción de enormes volúmenes de de
agua y convierten a este GAG en un elemento particularmente determinante de la
hidratación tisular68. Adicionalmente, el ácido hialurónico está
implicado en otras funciones, tales como la reparación tisular69 y la
protección frente a infecciones y encimas proteolíticas de los granulocitos70.
2.1.b Grupos de
proteoglicanos y sus funciones
i) Hialecticanos. La familia de los lecticanos está compuesta por
cuatro PGs de tipo condroitín-sulfato (CSPGs). El agrecano (GSPG1) y el
versicano (CSPG2) están distribuidos de forma relativamente amplia, mientras
que el neurocano (CSPG3) y el brevicano (CSPG7) están básicamente restringidos
al sistema nervioso central72,73,74.
Todos los lecticanos son CSPGs secretados con una estructura consistente en un
amplio dominio globular a cada extremo y un dominio intermedio desplegado que
porta las cadenas de CS75. Mediante
sus dominios globulares, los lecticanos interactúan con el ácido hialurónico,
constituyendo los principales elementos proteicos de unión entre este
componente básico de la MEC y la superficie celular72. Aunque presentan una elevada homología en lo que a los
dominios globulares se refiere, la región intermedia varía considerablemente en
términos de secuencia, longitud y número de cadenas de CS. Se conocen variantes
de splicing, glicoformas y productos
truncados estables que aumentan todavía más la heterogeneidad de esta pequeña
familia de PGs76.
El versicano es el miembro más ubicuo de esta
familia, y su expresión ha sido detectada a nivel cardiaco77. Existen cuatro isoformas de esta proteína
obtenidas por splicing alternativo
(V0-V3). Sus diferencias se basan en la longitud de la región interna y por
tanto en el número de anclajes posibles para el CS, estando la forma V3
desprovista de estos78. Además de
reconocer al ácido hialurónico, el versicano interacciona con otras proteínas
de la MEC como tenascinas, fibulinas, fribrilinas o fibronectina. Gracias
a sus cadenas de CS, el versicano
es reconocido por selectinas y el PG
de membrana CD44, y su núcleo proteico es reconocido por otros receptores
celulares tales como las integrinas. Todo ello permite al versicano intervenir
en procesos que rigen por ejemplo la adhesión celular y la transducción de
señales MEC-célula46.
ii) SLRPs. Los proteoglicanos de la familia SLRPs (small leucine-rich proteoglycans) son
componentes biológicamente activos de la MEC pertenecientes a la superfamilia
de proteínas con repeticiones ricas en leucina (LRRs)79. Están extendidos por una gran variedad de
tejidos. Su característica principal es la presencia de LRRs flanqueadas por
clusters de cisteína en el núcleo proteico80,81,82,83. Tras su síntesis, los SLRPs
son secretados al espacio pericelular en donde interaccionan con diferentes
moléculas del espacio extracelular y la membrana plasmática, modulando una
amplia variedad de procesos81,83,84,85,86. Así, los SLRPs participan en la fibrilogénesis del
colágeno y controlan la disponibilidad de factores de crecimiento, regulando
directamente el crecimiento celular87.
Los SLRPs se organizan en
cinco clases diferentes basándose en los clusters de cisteína a N-terminales,
las repeticiones C-terminales (u orejuelas) (específicas de los SLRPs), su
organización cromosómica y las homologías a nivel de secuencia aminoacídica y nucleotídica.
Estudios en ratones knockout han demostrado cierto grado
solapamiento funcional entre los diferentes SLRPs88. La decorina es quizá el arquetipo de SLRP. Está compuesta
por tres dominios: una región N-terminal que contiene el primer cluster
flanqueante de cisteínas y la única cadena lateral de GAG (CS/DS), una región
central con diez LRRs que constituye el principal elemento de interacción con
otras proteínas, y una región C-terminal que contiene el segundo cluster
flanqueante de cisteínas83. La decorina es capaz de
unirse a los colágenos I89, III90 y VI91, así como a TGFb (Transforming growth factor beta)92 y otras proteínas, inhibiendo el crecimiento en
varios tipos celulares y controlando en parte la fibrilogénesis colágena93,94.
iii) Proteoglicanos de la membrana basal: Dos PGs aparecen como
componentes fundamentales de las membranas basales de mamíferos: perlecano y
agrina95. El primero, de 469kDa, es
un componente fundamental para la estabilidad de las membranas basales del
miocardio96, presentando dominios de
interacción con otros componentes de la membrana basal como colageno IV y laminina97 y de la superficie celular98. El dominio N-terminal contiene la mayoría de los lugares de anclaje para
GAGs HS que combinados con su posición en la membrana basal y a la diversidad
de dominios que presenta el núcleo proteico, permiten al perlecano controlar la
concentración pericelular de gran cantidad de moléculas99. Interesantemente, la endorrepelina, péptido
N-terminal del perlecano liberado por acción proteolítica, posee importantes
propiedades angiostáticas100.
Por su
parte, la agrina es una proteína constituida por cuatro dominios que comparten
similitudes con el perlecano y la laminina. Presenta sitios de unión para al
menos seis residuos HS y cinco sitos de N-glicosilación. Entre sus diversas
funciones, la agrina resulta un componente fundamental en las uniones
neuromusculares101.
Los
colágenos XV y XVIII son PGs de la membrana basal102, y serán tratados en el apartado
correspondiente a los colágenos de la familia de las multiplexinas.
vi) Proteoglicanos de la membrana plasmática. Existen diversas familias de PGs en las que el
núcleo proteico se halla en parte integrado en la membrana plasmática, con sus
regiones de unión a GAGs en la cara extracelular de la membrana. Estos PGs son
importantes pues ejercen funciones de anclaje y señalización entre célula y
MEC. Sindecanos y distroglicanos forman parte de este grupo que será brevemente
tratado en el apartado correspondiente a proteínas mediadoras de la interacción
célula-matriz.
2.2 Colágenos
Los colágenos son una amplia familia de
proteínas con conformación en triple hélice presentes en gran número de
tejidos. La presencia de los diferentes tipos de colágeno es importante para
una gran cantidad de funciones que van desde el soporte estructural del tejido
hasta la adhesión y migración celular, la angiogénesis o la reparación tisular.
Sus formas fibrilares son el principal elemento ténsil de variedad de tejidos,
pero diversos tipos de colágeno forman redes en lugar de fibras, y son parte
fundamental de las membranas basales. En los últimos años han sido
identificadas nuevas formas de colágeno con dominios transmembrana, que han
puesto todavía más de manifiesto la ubicuidad y multifuncionalidad de esta
familia de proteínas.
Estructuralmente, los colágenos contienen
tres cadenas polipeptídicas alfa que forman una superhélice dextrógira con
escalonamiento de un residuo entre cadenas adyacentes y enlazadas entre ellas
mediante puentes de hidrógeno103. Existen formas heterotriméricas
(p.e. colágenos I y III), pero sin embargo resultan más comunes las estructuras
homotriméricas, con tres cadenas idénticas (colágeno XVIII). La composición canónica de
cada cadena está enriquecida en repeticiones de tripletes comenzando por un
residuo de glicina y con la segunda y tercera posición ocupadas por prolina y
4-hidroxiprolina respectivamente104. Esta estructura básica se ve modificada en las diferentes formas de
colágeno para dar lugar a la variedad estructural responsable de la diversidad
funcional y espacial de esta familia105. Los extremos N- y C- terminales
de las cadenas presentan dominios que no se corresponden con el patrón descrito
hasta ahora, conocidos como dominios de tipo no colágeno (NC), nombrándose
desde el extremo C-terminal en orden numérico.
El colágeno
I es la forma arquetípica de colágeno. Conserva la estructura en triple
hélice sin imperfecciones y se ensambla en forma de fibras para tener un papel
predominantemente estructural en una enorme variedad de tejidos. En mamíferos
es la proteína más abundante del organismo y se trata además de la proteína
estructural más abundante de la MEC del corazón sano. Existen al menos 28
formas de colágeno en vertebrados que difieren en mayor o menor grado del
prototípico colágeno I, pero sin embargo, la línea que separa los colágenos de
todas aquellas proteínas denominadas parecidas-a-colágeno (e.g.
acetil-colinesterasa, adiponectina, C1q, ficolina etc) es difusa106. Es común incluso, que algunas formas de colágeno (XVIII, IX) aparezcan
modificadas con cadenas de GAGs, lo que refleja una vez más la dificultad de
establecer clasificaciones estrictas de los colágenos, y de los componentes de
la MEC en general. Partiendo de la estructura básica antes mencionada, se
suelen referir como colágenos, aquellas proteínas con estructura en triple
hélice que tienen funciones en la estructura del tejido o el mantenimiento de
esta. A continuación se describen, de forma resumida, las diferentes familias estructurales de colágenos,
haciendo especial hincapié en los miembros arquetípicos de cada familia o
aquellos que presenten una mayor relevancia para los objetivos de este trabajo.
i) Colágenos que forman fibras. Este grupo está representado por los colágenos I, II, III, V, XI, XXIV y XXVII, que
constituyen la principal fuente de fuerza ténsil en los tejidos animales. El
diámetro y longitud de las fibras es muy variable107,
pero las propiedades ténsiles de las matrices de colágenos fibrilares no
dependen exclusivamente del crecimiento en tamaño de las fibras, sino de
entrecruzamientos intra e intermoleculares entre ellas108. En mamíferos existen 11 genes distintos
para colágenos fibrilares80 y, con
la excepción de los colágenos XXIV y XXVII, todos contienen un dominio no
interrumpido formador de fibras de unos 1000 aminoácidos de longitud. Todos
ellos se sintetizan en forma de procolágenos, conteniendo telopéptidos o
propéptidos N- y C-terminales109 con
lugares importantes de anclaje para la fibrilogénesis. En el corazón, el
colágeno I es sintetizado principalmente por los cardiofibroblastos y esta
sujeto a un lento metabolismo110 .
ii) FACITs: Colágenos asociados a fibras con
interrupciones en la triple hélice. Compuesto por los colágenos IX, XII, XIV, XVI, XIX, XX, XXI y XXII. Son
formas de colágeno de longitudes relativamente pequeñas y con interrupciones en
la triple hélice. Contienen uno o dos dominios colágenos que se anclan a la
superficie de colágenos fibrilares. El representante más estudiado de este
grupo es el colágeno IX, que contiene una cadena de GAG y se une covalentemente
a las fibras de colágeno II en el cartílago111.
De modo similar, los colágenos de tipo XII y XIV se encuentran normalmente
asociados a fibras de colágeno I112,113,
además de interactuar con diversos PGs de la familia SLRP114.
iii) Colágenos que forman redes laminares. Forman parte de esta familia los colágenos IV, VIII
y X. Sus funciones son diversas, sirviendo como soporte para células y tejidos,
como filtros moleculares y como barreras permeables en el embrión en desarrollo115. El colágeno IV, componente principal de
todas las membranas basales es el miembro más ampliamente caracterizado de esta
familia. Las tres hélices que componen la unidad básica del colágeno IV están
codificadas por seis genes diferentes (α1 a α6), pero sólo se combinan de tres
formas: α1α1α2, α3α4α5 y α5α5α6.
Cada cadena contiene un dominio N-terminal llamado 7S, un dominio tipo
colágeno de 120 kDa, y un dominio globular C-terminal NC1116. Tanto el dominio 7S como el NC1 resultan
fundamentales para la formación de la red de colágeno IV37. Las redes formadas por combinación de las
triples hélices proporcionan el andamio sobre el que otros componentes de la
membrana basal como las lamininas, el perlecano y otros proteoglicanos pueden
interactuar117. A nivel celular, el
colageno IV interactúa con receptores de integrinas y DDR1 (discoidin domain receptor 1) 118.
iv) Colágenos que forman fibras de anclaje. El colágeno VII es el
único miembro de esta familia y el componente mayoritario de las fibras de
anclaje. Estas estructuras especializadas proporcionan una unión adicional
entre la membrana basal y la matriz intersticial subyacente119. El colágeno VII ha sido mayoritariamente
estudiado en la piel120. Estructuralmente se trata de un homotrímero cuya cadena consiste en un
segmento central de 145 kDa, que forma la triple hélice, un segmento NC1
(N-terminal) y un pequeño segmento NC2, C-terminal121. En el espacio extracelular, las triples
hélices forman dímeros antiparalelos que interactúan con el cólageno tipo IV,
la laminina 332122 y el colágeno I123.
v) Colágenos en forma de collar de cuentas. Esta familia reúne a los colágenos VI, XXVI y
XXVIII. El colágeno VI es una proteína fundamental de la matriz extracelular de
tejidos musculares entre otros, y forma redes microfibrilares asociadas con la
membrana basal. La unidad básica se compone de tres cadenas distintas: α-1 y
α-2, ambas de 140kDa y α-3, de hasta 300kDa. Esta unidad se ensambla en
tetrámeros en un proceso de varios pasos que comienza en el interior de la
célula y termina en el espacio extracelular. Las microfibrillas formadas por
los tetrámeros se anclan a diferentes moléculas que incluyen otros componentes
de la MEC como el colágeno IV y el biglicano, o receptores de adhesión celular
como las integrinas124,125. Así, el
colágeno VI promueve la estabilidad de la membrana sarcolémica durante la
contracción muscular126, interviene en el ensamblaje de la
membrana basal y controla eventos de señalización celular tales como la
supervivencia celular y la regulación del tamaño de las miofibras125.
vi) Multiplexinas. Los colágenos XV y XVIII son proteoglicanos
estructuralmente homólogos caracterizados por la presencia de una triple hélice
central interrumpida y flanqueada por regiones NC. Los dominios de interrupción
aportan flexibilidad entre regiones en triple hélice y permiten la formación de
polímeros estructuralmente diferentes a aquellos formados por los colágenos
fibrilares62. El colágeno XVIII está
unido a GAGs HS, mientras que el XV aparece unido a CS127. En el corazón,
el colágeno XV es más abundante que el XVIII, pero ambos son ubicuos y aparecen
en membranas basales de diferentes tejidos128.
Aunque también se encuentran en otros colágenos, las multiplexinas poseen en
sus dominios NC1, regiones con actividad independiente de su pertenencia a la
molécula completa de colágeno. La restina y la endostatina (fragmentos
proteolíticos derivados de los colágenos XV y XVIII, respectivamente), pueden
ser liberadas por acción proteolítica y unirse a diversas moléculas de la
matriz extracelular y la superficie celular ejerciendo importantes efectos
sobre la adhesión y la migración celular129
o la angiogénesis130.
vi) MACITs: colágenos asociados a membrana
con interrupciones en la triple hélice. Los colágenos XIII, XXIII y XXV son proteínas transmembrana de tipo II
que contienen un corto dominio N-terminal citosólico y un largo domino
C-terminal extracelular con estructura de triple hélice interrumpida, diana de
diversas proteasas. Esta familia de colágenos posee propiedades de adhesión y
su número de miembros identificados continúa en aumento131.
2.3. Glicoproteínas
La glicosilación es la unión covalente de moléculas
de carbohidratos a la superficie de las proteínas. Se trata de la modificación
postraduccional más prevalente y estructuralmente compleja136. Desde un punto de vista estructural
existen dos tipos de glicoproteínas: las N-glicosiladas, en las que el azúcar
se une al nitrógeno amida de la asparragina137,
y las O-glicosiladas, en las que el enlace se produce a través oxígeno
hidroxilo de la hidroxilisina, hidroxiprolina, serina o treonina138. Numerosos estudios han demostrado que la
glicosilación natural incrementa la estabilidad molecular de las proteínas139. En la MEC, muchas glicoproteínas tienen
papeles fundamentales en la estructura y adhesión de la membrana basal140 o como moléculas reguladoras de diversos
procesos141,142.
a)
Glicoproteínas mediadoras de la adhesión celular
Debido a la presencia de dominios especializados y
residuos de carbohidratos, las glicoproteínas resultan componentes
fundamentales para la adhesión celular, mediando el anclaje de las células a la
membrana basal. Las lamininas143 y
la fibronectina son las glicoproteínas mejor caracterizadas en esta función.
Además, su presencia se extiende a una gran gama de tejidos144.
Lamininas. Las lamininas
son proteínas heterotriméricas compuestas por diferentes combinaciones de
cadenas a, b y γ. Actualmente
se conocen 5 cadenas-a diferentes, 4 b y 3 γ, así como diferentes variantes
de splicing de las mismas145. Una
forma común de esta proteína, la laminina 332, estaría compuesta por una unidad
a-3, una b-3 y una γ-2146. Los
diferentes trímeros tienen una distribución tejido-específica97 y juegan un papel importante para la
estructura de la MEC y el anclaje de las células a la membrana basal. Las
lamininas con forma de cruz completa son capaces de polimerizar para dar estructuras supramoleculares en
forma de red147 que constituyen un
componente básico de las membranas basales. La incorporación de moléculas de
laminina a la MEC está mediada por interacciones con otras proteínas tales como
colágeno IV, nidógeno, fibulina y otras lamininas97.
Fibronectina. De modo natural, la fibronectina está presente en
forma de dímero en el plasma sanguíneo a concentraciones micromolares. Cada
subunidad está constituida por un mosaico de módulos repetidos de tipo I (12),
tipo II (2) y tipo III (15-17), y una región variable no homóloga a otras
partes de la fibronectina. Al contrario que la laminina, la fibronectina no
polimeriza en condiciones fisiológicas normales y su presencia es reducida en
la membrana basal, puesto que no existe una acumulación pasiva relevante y ésta
se restringe a zonas especializadas de la superficie celular148. Sin embargo, durante el desarrollo
embrionario o situaciones de daño tisular (p.e. infarto de miocardio o hipertensión),
su expresión se ve incrementada y además el tejido recluta fibronectina
circulante. La fibronectina interviene entonces en la comunicación célula-MEC y
la migración celular a través de su interacción con integrinas y otros
receptores transmembrana149.
b) Glicoproteínas matricelulares
Las proteínas matricelulares son un grupo heterogéneo de proteínas que
interaccionan con receptotes celulares de superficie, la MEC, factores de
crecimiento y proteasas, pero no funcionan como proteínas estructurales per se150.
Por ejemplo, la trombospondina 1,
SPARC o tenascina C son capaces de interrumpir interacciones célula-matriz que
intervienen como componentes críticos en procesos tales como el remodelado
tisular y la angiogénesis151,152 .
Debido a la diversidad molecular y funcional de este grupo de proteínas,
resulta inadecuado elegir un modelo arquetípico o centrarse en algún ejemplo
concreto dentro de esta clase. De este modo, aquellas proteínas que resultasen
de interés una vez llevados a cabo los experimentos, serán tratadas de modo más
detallado en la discusión de este trabajo.
2.4 Proteínas de
membrana mediadoras de la interacción célula-MEC
La función de las proteínas del espacio
extracelular no puede ser entendida sin tener en cuenta su interacción con el
componente celular del tejido. Diversas proteínas resultan fundamentales en el
establecimiento de esta comunicación. A continuación, se tratarán brevemente
los aspectos básicos de estas.
Integrinas. Estos receptores son
heterodímeros transmembrana compuestos de subunidades α y β, con un largo dominio extracelular y un pequeño
dominio intracelular altamente conservado153.
El dominio extracelular interactúa con diversos componentes de la MEC154 y el dominio intracelular lo hace tanto con
moléculas de señalización celular como con componentes del citoesqueleto. En
mamíferos existen 24 pares (αβ) de receptores diferentes que pueden solaparse en
el reconocimiento de ligandos155. Los
cardiofibroblastos expresan mayoritariamente el par α5β1,
que reconoce fibronectina y osteopontina, y los pares αVβ1,
α5β3 y α5β3, que unen
adicionalmente vitronectina156. Los
cardiomiocitos adultos expresan el dímero α7β1, receptor
de laminina157. Sin embargo, aunque
cada tipo celular posee una firma particular de integrinas, esta cambia rápida
y dinámicamente una vez las células son extraídas de su entorno normal158. En general, se puede decir que las
integrinas constituyen el principal enlace entre la MEC y el citoesqueleto159, e integran a ambos no sólo a nivel
mecánico, sino como elemento activo de la señalización celular158.
Sindecanos. Los sindecanos son una familia de proteoglicanos con núcleos proteicos
transmembrana. Poseen un corto domino citoplasmático y un dominio extracelular
con residuos de anclaje para HS y CS, que permiten la interacción con un amplio
número de factores de crecimiento y proteínas de la MEC160,161. En cardiofibroblastos, el
reconocimiento de fibronectina por el sindecano-4 es necesario para una
apropiada migración celular162 y el
sindecano-1 contribuye a la fibrosis cardiaca inducida por angiotensina II163.
Distroglicanos. Los distroglicanos α y β son los productos de un mismo transcrito que tras
su traducción sufre acción proteolítica. El α-distroglicano
(68kDa) se localiza en el espacio pericelular unido de forma no covalente al β-distroglicano (27 kDa), una pequeña proteína transmembrana164. El α-distroglicano
está altamente glicosilado y mediante su unión a lamininas, agrina y perlecano
contribuye de modo importante a la interacción célula-MEC165 .
CD44/epicano. El epicano es una glicoproteína transmembrana codificada por un gen único
aunque expresada en diferentes formas por medio de splicing alternativo y diferentes modificaciones prostraducionales166. Su largo dominio extracelular presenta un
dominio de interacción con ácido hialurónico167, aunque se ha demostrado la interacción de CD44 con
otros GAGs y diferentes proteinas de la MEC168 y metaloproteinasas de matriz (MMPs)169, soportando la noción de que este receptor de membrana posee un papel
importante en la señalización célula-MEC170 .
DDRs. Las proteínas DDR (discoidin
domain receptors) son receptores tirosina-kinasa importantes en la
interacción célula-MEC. DDR2 en concreto, está considerado un marcador para
determinadas poblaciones de fibroblastos cardiacos y es un receptor de
colágenos fibrilares que media la migración y la proliferación de fibroblastos171.
3. Homeostasis
de la MEC cardiaca: Las metaloproteasas de matriz
El remodelado lento y moderado de la MEC es
característico del tejido cardiaco sano: la síntesis y la degradación de matriz
se encuentran en equilibrio dinámico. Como ya se ha visto, la base estructural
de la MEC cardiaca es el colágeno I, que resulta extremadamente resistente a la
acción proteolítica172, pero muchos
otros componentes son también partes importantes de la composición de la MEC.
El mantenimiento adecuado del equilibrio en la MEC está sujeto a la acción de
varios grupos de enzimas proteolíticas que toman parte en la degradación de los
diferentes componentes. Entre estas enzimas se encuentran ADAM (A disintegrin and metalloprotease
domanin-containing protein), proteasas séricas (plasmina, elastasa derivada
de neutrófilos, catepsina G etc), cisteín-proteasas (catepsinas B, L y S),
aspartil-proteasas (catepsina D) y MMPs173
.
Las MMPs resultan especialmente
relevantes para el remodelado de la MEC cardiaca en condiciones sanas y
patológicas. Se trata de una familia de más de 25 proteasas que utilizan zinc
como cofactor. En general son sintetizadas como pro-MMPs inactivas en las que
el dominio catalítico permanece inaccesible debido a la interacción del propéptido
N-terminal con el Zn+2. Una vez el propéptido es liberado por acción
proteolítica, el centro catalítico queda expuesto y la enzima activada174. Tras ser secretadas, las pro-MMPs se unen
a diversas moléculas de la MEC y permanecen en estado latente, constituyendo un
reservorio que puede ser activado de modo inmediato ante una eventual demanda
de actividad proteolítica en el tejido175.
Las MMPs identificadas hasta el
momento en el miocardio pertenecen a cuatro familias175,176 y son sintetizadas por todos los tipos
celulares mayoritarios del miocardio. En conjunto, pueden degradar la práctica
totalidad de proteínas presentes en la MEC175
y la relación de sustratos identificados permanece en constante aumento177 (Tabla 1).
Tabla 1.
MMPs identificadas en el corazón. Cuatro familias de MMPs
están representadas en el tejido cardiaco, pudiendo degradar un enorme abanico
de sustratos. Modificado de Somerville et al, 2003178
Nombre
|
Código
Uniprot
|
Sustratos
|
Colagenasas
|
|
|
Colagenasa
intersticial
|
MMP1
|
Colágenos
tipo I, II, III, VII, VIII, X, y gelatina. Agrecano, nidógeno, versicano,
perlecano y tenascina-C.
|
Colagenasa 3
|
MMP13
|
Colágenos
tipo I, II, III, IV, V, IX, X, XI, y gelatina. Agrecano, fibronectina,
laminina, perlecano, tenascina, pro-MMP-9 y pro-MMP-13.
|
Colagenasa neutrófila
|
MMP8
|
Colágenos
tipo I, II, III, V, VII, VIII, X, y gelatina. Agrecano, laminina, nidógeno y
pro-MMP-8.
|
Gelatinasas
|
|
|
Gelatinasa
A
|
MMP2
|
Colágenos tipo I, IV, V, VII, X, XI, XIV, y gelatina.
Agrecano, elastina, fibronectina, laminina, nidógeno, versicano. MMP-9, MMP-13.
|
Gelatinasa B
|
MMP9
|
Colágenos
tipo IV, V, VII, X, XIV y gelatina. Fibronectina, laminina, nidógeno,
versicano y TGF-β.
|
Estromelisinas
|
|
|
Estromelisina
1
|
MMP3
|
Colágenos
tipo II, IV, IX, X, y gelatina. Agrecano,
decorina, elastina, fibronectina, laminina, nidógeno, perlecano, versicano,
pro-MMP-1, pro-MMP8 y pro-MMP-9.
|
Matrilisina
|
MMP7
|
Colágenos
tipo I, II, III, V, IV y X. Agrecano, elastina, laminina, decorina,
pro-MMP-2, pro-MMP-7, integrina β4 y sindecano.
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MMPs de membrana
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MT1-MPP
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MMP14
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Colágenos
tipo I, II, III y gelatina. Agrecano, fibronectina, laminina, nidógeno,
perlecano, tenascina, vitronectin, pro-MMP2, pro-MMP-13, varias integrinas y
CD44.
|
La importancia de las MMPs va más
allá de la degradación de proteínas de la MEC. Varias MMPs tienen dianas
proteolíticas en citoquinas, péptidos bioactivos y factores de crecimiento,
afectando a su vez a diversos procesos en el miocardio179,180,181. Algunas MMPs tendrían incluso la
capacidad de reconocer pro-MMPs e inducir su activación182.
Debido a la eficacia de estas
enzimas degradando sus sustratos, el establecimiento de un estricto control de
su actividad resulta fundamental. Las TIMPs (tissue inhibitors of matrix metaloproteases) son proteínas de bajo
peso molecular que se unen ávidamente a MMPs inhibiendo su actividad. TIMP-4 es
la forma con mayor expresión en el tejido cardiaco183.
Además de MMPs, las TIMP inhiben otras proteasas con importantes papeles sobre
la MEC. TIMP-4 en concreto, reconoce las proteasas de la familia ADAM ADAM-17,
-28 y -33, resaltando la importancia de las TIMPs en la regulación de los
procesos de remodelado en la MEC184.
Como se verá más adelante, la actuación de las MMPs resulta importante para el
desarrollo de diversas patologías cardiovasculares. El control de su
activación, pero también de su transcripción, son procesos altamente regulados
que dependen de diversas vías de activación y represión185 en las que intervienen citoquinas, factores
de crecimiento, péptidos bioactivos y estímulos físicos186,187. En conjunto, todos ellos contribuyen
de forma esencial al mantenimiento en la MEC de un entorno que permita el
correcto desarrollo de los procesos que resultarán en una apropiada función
cardiaca.