1. Organización y funciones de los componentes del espacio extracelular.

El corazón es un órgano único. Su funcionamiento como motor del sistema circulatorio tiene sus pilares en una estructura tisular especialmente adaptada para satisfacer las demandas de actividad durante etapas de reposo y ejercicio. Sin embargo, ninguno de los procesos que ocurren durante la contracción cardiaca puede ser completamente comprendido sin tener en cuenta el papel de la MEC. Esta estructura tridimensional sirve como esqueleto para todas las células contenidas en el miocardio pero, lejos actuar como mero andamio, sus funciones a muchos otros niveles hacen posible un amplio abanico de procesos cardiacos. Al actuar como base de anclaje para los componentes celulares del miocardio y nexo de comunicación entre estos, la MEC integra en cada excitación el aporte de cada célula individual, permitiendo la contracción coordinada y conjunta del tejido a nivel macroscópico. El entorno tridimensional que aporta al miocardio (en conjunto referido como espacio extracelular) hace posible la distribución de una gran variedad de proteínas y otras moléculas solubles relacionadas con multitud de procesos. Además, diversos componentes de la MEC sirven como lugares específicos de anclaje para muchas de estas moléculas solubles, que ven afectadas su disponibilidad y circulación. Otros componentes, extremadamente hidrofílicos,  desarrollan un papel fundamental acumulando agua, que aporta una excelente resistencia a la compresión. La organización, composición y densidad de la MEC son dinámicas, no sólo en condiciones patológicas, sino en condiciones normales. Estas tres propiedades se mantienen en constante cambio atendiendo a eventuales demandas, y todas tienen un importante impacto sobre la función del miocardio¹².

Por todo lo expuesto, no resulta coherente estudiar el espacio extracelular como una entidad aislada e independiente, sino que es necesario tener en cuenta la presencia de todos aquellos elementos que pueblan el espacio tridimensional provisto por la MEC para justificar la presencia de ésta. Aunque funcionando como un conjunto, el espacio extracelular puede ser dividido en tres estructuras de orden inferior. Las dos primeras, la membrana basal y la matriz intersticial, forman parte del andamio estructural creado por la MEC. La tercera, el fluido extracelular, aunque con una indudable contribución a la estructura, aporta sobre todo una vía de comunicación entre todos los elementos componentes del tejido.

La membrana basal. La membrana basal es un complejo proteico especializado de la MEC que subyace a todas las monocapas celulares del organismo. Su  estrecha relación con las células es fundamental ya que provee a los tejidos de estabilidad mecánica y también de señales que determinan la polaridad celular y la migración. En el corazón, sus constituyentes mayoritarios a nivel proteico son las lamininas, colágenos IV, XV y XVIII, perlecano, agrina y nidógenos 1 y 2^35,36,37,38.

La matriz intersticial. La matriz intersticial es la entidad de la MEC que contribuye en mayor medida a las propiedades mecánicas del tejido. Aparece físicamente anclada a la membrana basal aunque forma una unidad funcional diferente que, además de dar resistencia mecánica y soporte estructural al miocardio, provee a este del compartimento extracelular a través del cual se distribuyen señales y nutrientes y migran los fibroblastos. En el corazón, sus componentes principales son los colágenos I, III, VI y XII, los proteoglicanos y las proteínas matricelulares que aparecen asociadas a los componentes anteriores³⁹.

El fluido extracelular. El fluido extracelular es el líquido que baña a todas las estructuras celulares y extracelulares de un tejido. Contiene elementos necesarios para el funcionamiento y viabilidad celular tales como iones (Na⁺,  K⁺,  Ca²⁺, Cl^- y HCO₃^-) , glucosa y otros azúcares, aminoácidos, ácidos grasos, neurotransmisores, hormonas y factores de crecimiento, citoquinas y otras proteínas. Estos elementos proceden de la secreción celular in situ y del plasma sanguíneo, que permanece en continuo intercambio con el fluido extracelular mediante filtración endotelial de los capilares. Los productos de secreción y de desecho de las células ejercen importantes papeles en la regulación autocrina y paracrina y son drenados hacia la circulación mediante el sistema linfático⁴⁰.

2. Componentes proteicos del espacio extracelular

El espacio extracelular está compuesto por una amalgama de componentes de naturaleza dispar. Proteínas, azúcares y lípidos, son componentes habituales de las diferentes entidades extracelulares ya descritas. Las proteínas son moléculas particularmente promiscuas en la asociación con otros componentes para dar elementos híbridos como son las glicoproteínas, proteoglicanos o lipoproteínas, contribuyendo todos ellos de forma definitiva al funcionamiento y mantenimiento del espacio extracelular como conjunto. Por este motivo, resulta complicado establecer una clasificación apropiada de los componentes proteicos de la MEC, tanto cardiaca como a nivel general. Las clasificaciones funcionales dan lugar a grupos filogenéticamente heterogéneos, mientras que organizaciones basadas exclusivamente en la filogenia producen grupos complicados de explicar funcionalmente. En muchos casos, aunque las homologías a nivel de secuencia son grandes, las modificaciones post-traduccionales provocan importantes diferencias, habiendo también variaciones en la distribución por tejidos.

De este modo, aunque no existe una clasificación de los componentes de la MEC adecuada para todos los abordajes, se describirá la que resulta más apropiada para este trabajo. De este modo, se tendrán en cuenta cuatro grupos de proteínas de la MEC: (1) proteoglicanos, (2) colágenos (3) glicoproteínas y (4) un grupo, más artificial, que reúne proteínas de membrana importantes para la interacción célula-MEC.  Otros componentes del espacio extracelular que por su heterogeneidad resultan inabordables como grupo, se tomarán en cuenta en base a los resultados.

2.1  Proteoglicanos

Aceptados como componentes estructurales importantes de la MEC del cartílago desde principios de los años 60, los proteoglicanos (PGs) fueron durante años considerados específicos de este tejido. Sin embargo, en las últimas décadas se ha puesto de manifiesto su presencia en todos los tejidos, donde aparecen distribuidos por la matriz intersticial y la membrana basal, además de conformar receptores de membrana importantes para la interacción célula-matriz⁴¹.

Los proteoglicanos presentan una estructura básica compuesta por un núcleo proteico y un número variable de cadenas de glicosaminoglicanos (GAGs) ancladas a la cadena aminoacídica en lugares específicos. Su diversidad se basa en los genes que codifican el núcleo proteico, el uso diferencial de exones contenidos en estos genes y la variedad en longitud, tipo y número de cadenas de GAGs⁴².

 

El hecho de que los proteoglicanos se pierdan durante los pasos de fijación tradicional, es quizá lo que ha provocado que pocos estudios clásicos acerca de la MEC en condiciones sanas y patológicas hayan prestado especial atención al contenido en proteoglicanos⁴³. A pesar de que el número total de proteoglicanos en mamíferos no supera la cincuentena, el rango de pesos moleculares de los distintos núcleos proteicos varía desde los apenas 20kDa del sindecano-4, hasta los 466 kDa del perlecano. El número de cadenas de GAGs es extremadamente variable, y puede ir desde una única cadena (decorina) hasta más de 100 (agrecano). Además, el contenido en GAGs es susceptible de verse afectado cuantitativa y cualitativamente por la edad, el ejercicio y diversas patologías⁴⁴. Cuando se utilizan técnicas de identificación en las que el peso molecular resulta una característica esencial (western blot), el número y tipo de cadenas de GAGs puede modificar el peso aparente de forma significativa puesto que afecta tanto al peso molecular como a la carga, y por tanto a las propiedades electroforéticas⁴².

2.1.a Glicosaminoglicanos (GAGs). Los GAGs son polisacáridos lineales largos, heterogéneos y negativamente cargados⁴⁵ constituyentes fundamentales de la matriz extracelular de todos los tejidos. Consisten en unidades repetitivas de disacáridos compuestos por un aminoazúcar y un ácido urónico. El aminoazúcar puede ser N-acetilgalactosamina (GalNAc) o N-acetilglucosamina (GlcNAc), y el ácido urónico será ácido glucourónico (GlcUA) o bien ácido idurónico (IdoUA). Los mecanismos que controlan la longitud de las cadenas de GAGs permanecen desconocidos⁴⁶. Con la excepción del ácido hialurónico, que además es el único GAG no sulfurilado, los GAGs aparecen normalmente unidos de forma covalente a un núcleo proteico⁴⁷.

Debido a sus cargas negativas, los GAGs en solución acuosa aparecen rodeados por una capa de moléculas de agua ocupando un enorme volumen hidrodinámico. Cuando la solución de GAGs es sometida a compresión, el agua es evacuada y los GAGs reducen su volumen hasta que la presión desaparece, recuperando su volumen original⁴⁵. Esta propiedad les permite actuar como amortiguadores naturales cuando forman parte de un tejido conectivo, y resulta fundamental en tejidos sometidos ciclos continuos de presión-descompresión tales como el cartílago o los músculos. Sin embargo, las funciones los GAGs se extienden mucho más allá de un mero papel estructural. Pueden unir citoquinas o factores de crecimiento regulando así su distribución y disponibilidad y ejercer acciones directas de señalización cuando son degradados. De este modo, los GAGs desarrollan una triple función como reservorios, sumideros y cofactores de una enorme cantidad de moléculas de señalización⁴⁸ que median la adhesión, crecimiento y diferenciación celular, controlando así eventos asociados con la inflamación⁴⁹, desarrollo neuronal⁵⁰, fibrosis⁵¹, o angiogénesis⁵² entre otros. Por este motivo, los GAGs poseen una importante cantidad de aplicaciones farmacéuticas como agentes anticoagulantes, antitrombóticos y antilipémicos⁴⁴.

Estructuralmente, existen cuatro familias de GAGs: (i) condroitin sulfato y dermatán sulfato, (ii) heparán sulfato y heparina, (iii) queratán sulfatos I y II y (iv) ácido hialurónico⁵³.

(i) Condroitin sulfato (CS) y dermatán sulfato (DS). Estos dos GAGs surgen del mismo precursor, la condroitina, con la unidad disacarídica repetitiva GalNAC(β1,4)GlcUA(β1,3)⁴⁴. Esta forma inicial conforma la estructura del CS, que se distribuye por una amplia variedad de tejidos incluyendo corazón y cartílago⁵⁴. Forma parte de proteoglicanos de la MEC como el versicano y el agrecano⁵⁵. El DS se considera una forma modificada del CS, derivada de la epimerización de residuos GalNAc a IdoA⁵⁶. Aparece distribuido principalmente en la piel, pero también se asocia con los proteoglicanos biglicano⁵⁷, versicano⁵⁸ y decorina⁵⁹, presentes en una gran variedad de tejidos.

(ii) Heparán sulfato (HS) y heparina. Los PGs heparán sulfato están presentes en la superficie de todas las células humanas⁴⁴. El HS es un polímero lineal de unidades repetitivas con una composición habitual GlcAβ(1,4)GlNAcα(1,4). Ejemplos de proteoglicanos-HS pertenecientes a la MEC son el perlecano⁶⁰, la agrina⁶¹ y el colágeno XVIII⁶². La heparina, puede ser considerado una forma modificada del HS, pero su expresión es mucho más restringida⁶³.

(iii) Queratán sulfato (KS). Los PGs con residuos de KS aparecen distribuidos en una gran variedad de tejidos. La principal particularidad del KS es la presencia de galactosa en lugar del ácido urónico en su unidad básica repetitiva. La estructura de esta unidad es Galβ(1-4)GlcNAcβ(1,3)⁶⁴. Existen dos clases fundamentales de queratán sulfato. El KSI se une al núcleo proteico en residuos de asparragina mediante enlace N-glicosídico. El KSII establece enlaces O-glicosílicos con residuos de serina o treonina⁶⁵. Algunos autores, establecen incluso una tercera clase de KS en el que el enlace O-glicosílico se establece con residuos de serina mediante una manosa intermedia⁶⁶. Son PGs-KS de la matriz extracelular el agrecano y diversos miembros de la familia SLRP⁶⁴, tratados con mayor detalle en secciones posteriores.

(iv) Ácido hialurónico. El ácido hialurónico es el GAG no sulfurilado más abundante en la MEC. Se diferencia de los otros GAG descritos hasta ahora porque nunca aparece unido covalentemente a un núcleo proteico y además, su cadena de disacáridos polimeriza en el espacio extracelular en lugar de en el aparato de Golgi. Su estructura flexible en espiral está compuesta por hasta 10.000 repeticiones del disacárido GlcUAβ(1,3)GlcNAcβ(1,4)⁴⁷. Resulta imprescindible para el ensamblaje de la matriz de los tejidos conectivos y la estabilización de elementos no estructurales o débilmente fijados a la estructura de la MEC⁶⁷. La gran longitud de sus cadenas, junto con la carga aniónica de éstas, provocan la atracción de enormes volúmenes de de agua y convierten a este GAG en un elemento particularmente determinante de la hidratación tisular⁶⁸. Adicionalmente, el ácido hialurónico está implicado en otras funciones, tales como la reparación tisular⁶⁹ y la protección frente a infecciones y encimas proteolíticas de los granulocitos⁷⁰.   

2.1.b Grupos de proteoglicanos y sus  funciones

i) Hialecticanos. La familia de los lecticanos está compuesta por cuatro PGs de tipo condroitín-sulfato (CSPGs). El agrecano (GSPG1) y el versicano (CSPG2) están distribuidos de forma relativamente amplia, mientras que el neurocano (CSPG3) y el brevicano (CSPG7) están básicamente restringidos al sistema nervioso central^72,73,74. Todos los lecticanos son CSPGs secretados con una estructura consistente en un amplio dominio globular a cada extremo y un dominio intermedio desplegado que porta las cadenas de CS⁷⁵. Mediante sus dominios globulares, los lecticanos interactúan con el ácido hialurónico, constituyendo los principales elementos proteicos de unión entre este componente básico de la MEC y la superficie celular⁷². Aunque presentan una elevada homología en lo que a los dominios globulares se refiere, la región intermedia varía considerablemente en términos de secuencia, longitud y número de cadenas de CS. Se conocen variantes de splicing, glicoformas y productos truncados estables que aumentan todavía más la heterogeneidad de esta pequeña familia de PGs⁷⁶.

El versicano es el miembro más ubicuo de esta familia, y su expresión ha sido detectada a nivel cardiaco⁷⁷. Existen cuatro isoformas de esta proteína obtenidas por splicing alternativo (V0-V3). Sus diferencias se basan en la longitud de la región interna y por tanto en el número de anclajes posibles para el CS, estando la forma V3 desprovista de estos⁷⁸. Además de reconocer al ácido hialurónico, el versicano interacciona con otras proteínas de la MEC como tenascinas, fibulinas, fribrilinas o fibronectina. Gracias a  sus cadenas de CS, el versicano es reconocido por selectinas y el PG  de membrana CD44, y su núcleo proteico es reconocido por otros receptores celulares tales como las integrinas. Todo ello permite al versicano intervenir en procesos que rigen por ejemplo la adhesión celular y la transducción de señales MEC-célula⁴⁶. 

ii) SLRPs. Los proteoglicanos de la familia SLRPs (small leucine-rich proteoglycans) son componentes biológicamente activos de la MEC pertenecientes a la superfamilia de proteínas con repeticiones ricas en leucina (LRRs)⁷⁹. Están extendidos por una gran variedad de tejidos. Su característica principal es la presencia de LRRs flanqueadas por clusters de cisteína en el núcleo proteico^80,81,82,83. Tras su síntesis, los SLRPs son secretados al espacio pericelular en donde interaccionan con diferentes moléculas del espacio extracelular y la membrana plasmática, modulando una amplia variedad de procesos^{81,83,84,85,86}. Así, los SLRPs participan en la fibrilogénesis del colágeno y controlan la disponibilidad de factores de crecimiento, regulando directamente el crecimiento celular⁸⁷.

Los SLRPs se organizan en cinco clases diferentes basándose en los clusters de cisteína a N-terminales, las repeticiones C-terminales (u orejuelas) (específicas de los SLRPs), su organización cromosómica y las homologías a nivel de secuencia aminoacídica y nucleotídica.

Estudios en ratones knockout han demostrado cierto grado solapamiento funcional entre los diferentes SLRPs⁸⁸. La decorina es quizá el arquetipo de SLRP. Está compuesta por tres dominios: una región N-terminal que contiene el primer cluster flanqueante de cisteínas y la única cadena lateral de GAG (CS/DS), una región central con diez LRRs que constituye el principal elemento de interacción con otras proteínas, y una región C-terminal que contiene el segundo cluster flanqueante de cisteínas⁸³. La decorina es capaz de unirse a los colágenos I⁸⁹, III⁹⁰ y VI⁹¹, así como a TGFb (Transforming growth factor beta)⁹² y otras proteínas, inhibiendo el crecimiento en varios tipos celulares y controlando en parte la fibrilogénesis colágena^93,94.

 

iii) Proteoglicanos de la membrana basal: Dos PGs aparecen como componentes fundamentales de las membranas basales de mamíferos: perlecano y agrina⁹⁵. El primero, de 469kDa, es un componente fundamental para la estabilidad de las membranas basales del miocardio⁹⁶, presentando dominios de interacción con otros componentes de la membrana basal como colageno IV y  laminina⁹⁷ y de la superficie celular⁹⁸. El dominio N-terminal contiene la mayoría de los lugares de anclaje para GAGs HS que combinados con su posición en la membrana basal y a la diversidad de dominios que presenta el núcleo proteico, permiten al perlecano controlar la concentración pericelular de gran cantidad de moléculas⁹⁹. Interesantemente, la endorrepelina, péptido N-terminal del perlecano liberado por acción proteolítica, posee importantes propiedades angiostáticas¹⁰⁰.

 

Por su parte, la agrina es una proteína constituida por cuatro dominios que comparten similitudes con el perlecano y la laminina. Presenta sitios de unión para al menos seis residuos HS y cinco sitos de N-glicosilación. Entre sus diversas funciones, la agrina resulta un componente fundamental en las uniones neuromusculares¹⁰¹.

Los colágenos XV y XVIII son PGs de la membrana basal¹⁰², y serán tratados en el apartado correspondiente a los colágenos de la familia de las multiplexinas.

vi) Proteoglicanos de la membrana plasmática. Existen diversas familias de PGs en las que el núcleo proteico se halla en parte integrado en la membrana plasmática, con sus regiones de unión a GAGs en la cara extracelular de la membrana. Estos PGs son importantes pues ejercen funciones de anclaje y señalización entre célula y MEC. Sindecanos y distroglicanos forman parte de este grupo que será brevemente tratado en el apartado correspondiente a proteínas mediadoras de la interacción célula-matriz.

2.2 Colágenos  

Los colágenos son una amplia familia de proteínas con conformación en triple hélice presentes en gran número de tejidos. La presencia de los diferentes tipos de colágeno es importante para una gran cantidad de funciones que van desde el soporte estructural del tejido hasta la adhesión y migración celular, la angiogénesis o la reparación tisular. Sus formas fibrilares son el principal elemento ténsil de variedad de tejidos, pero diversos tipos de colágeno forman redes en lugar de fibras, y son parte fundamental de las membranas basales. En los últimos años han sido identificadas nuevas formas de colágeno con dominios transmembrana, que han puesto todavía más de manifiesto la ubicuidad y multifuncionalidad de esta familia de proteínas.

Estructuralmente, los colágenos contienen tres cadenas polipeptídicas alfa que forman una superhélice dextrógira con escalonamiento de un residuo entre cadenas adyacentes y enlazadas entre ellas mediante puentes de hidrógeno¹⁰³. Existen formas heterotriméricas (p.e. colágenos I y III), pero sin embargo resultan más comunes las estructuras homotriméricas, con tres cadenas idénticas (colágeno XVIII). La composición canónica de cada cadena está enriquecida en repeticiones de tripletes comenzando por un residuo de glicina y con la segunda y tercera posición ocupadas por prolina y 4-hidroxiprolina respectivamente¹⁰⁴. Esta estructura básica se ve modificada en las diferentes formas de colágeno para dar lugar a la variedad estructural responsable de la diversidad funcional y espacial de esta familia¹⁰⁵. Los extremos N- y C- terminales de las cadenas presentan dominios que no se corresponden con el patrón descrito hasta ahora, conocidos como dominios de tipo no colágeno (NC), nombrándose desde el extremo C-terminal en orden numérico.

El colágeno I es la forma arquetípica de colágeno. Conserva la estructura en triple hélice sin imperfecciones y se ensambla en forma de fibras para tener un papel predominantemente estructural en una enorme variedad de tejidos. En mamíferos es la proteína más abundante del organismo y se trata además de la proteína estructural más abundante de la MEC del corazón sano. Existen al menos 28 formas de colágeno en vertebrados que difieren en mayor o menor grado del prototípico colágeno I, pero sin embargo, la línea que separa los colágenos de todas aquellas proteínas denominadas parecidas-a-colágeno (e.g. acetil-colinesterasa, adiponectina, C1q, ficolina etc) es difusa¹⁰⁶. Es común incluso, que algunas formas de colágeno (XVIII, IX) aparezcan modificadas con cadenas de GAGs, lo que refleja una vez más la dificultad de establecer clasificaciones estrictas de los colágenos, y de los componentes de la MEC en general. Partiendo de la estructura básica antes mencionada, se suelen referir como colágenos, aquellas proteínas con estructura en triple hélice que tienen funciones en la estructura del tejido o el mantenimiento de esta. A continuación se describen, de forma resumida, las diferentes familias estructurales de colágenos, haciendo especial hincapié en los miembros arquetípicos de cada familia o aquellos que presenten una mayor relevancia para los objetivos de este trabajo.

i) Colágenos que forman fibras. Este grupo está representado por los colágenos  I, II, III, V, XI, XXIV y XXVII, que constituyen la principal fuente de fuerza ténsil en los tejidos animales. El diámetro y longitud de las fibras es muy variable¹⁰⁷, pero las propiedades ténsiles de las matrices de colágenos fibrilares no dependen exclusivamente del crecimiento en tamaño de las fibras, sino de entrecruzamientos intra e intermoleculares entre ellas¹⁰⁸. En mamíferos existen 11 genes distintos para colágenos fibrilares⁸⁰ y, con la excepción de los colágenos XXIV y XXVII, todos contienen un dominio no interrumpido formador de fibras de unos 1000 aminoácidos de longitud. Todos ellos se sintetizan en forma de procolágenos, conteniendo telopéptidos o propéptidos N- y C-terminales¹⁰⁹ con lugares importantes de anclaje para la fibrilogénesis. En el corazón, el colágeno I es sintetizado principalmente por los cardiofibroblastos y esta sujeto a un lento metabolismo¹¹⁰ .

ii) FACITs: Colágenos asociados a fibras con interrupciones en la triple hélice. Compuesto por los colágenos IX, XII, XIV, XVI, XIX, XX, XXI y XXII. Son formas de colágeno de longitudes relativamente pequeñas y con interrupciones en la triple hélice. Contienen uno o dos dominios colágenos que se anclan a la superficie de colágenos fibrilares. El representante más estudiado de este grupo es el colágeno IX, que contiene una cadena de GAG y se une covalentemente a las fibras de colágeno II en el cartílago¹¹¹. De modo similar, los colágenos de tipo XII y XIV se encuentran normalmente asociados a fibras de colágeno I^112,113, además de interactuar con diversos PGs de la familia SLRP¹¹⁴.

iii) Colágenos que forman redes laminares. Forman parte de esta familia los colágenos IV, VIII y X. Sus funciones son diversas, sirviendo como soporte para células y tejidos, como filtros moleculares y como barreras permeables en el embrión en desarrollo¹¹⁵. El colágeno IV, componente principal de todas las membranas basales es el miembro más ampliamente caracterizado de esta familia. Las tres hélices que componen la unidad básica del colágeno IV están codificadas por seis genes diferentes (α1 a α6), pero sólo se combinan de tres formas: α1α1α2, α3α4α5 y α5α5α6.

Cada cadena contiene un dominio N-terminal llamado 7S, un dominio tipo colágeno de 120 kDa, y un dominio globular C-terminal NC1¹¹⁶. Tanto el dominio 7S como el NC1 resultan fundamentales para la formación de la red de colágeno IV³⁷. Las redes formadas por combinación de las triples hélices proporcionan el andamio sobre el que otros componentes de la membrana basal como las lamininas, el perlecano y otros proteoglicanos pueden interactuar¹¹⁷. A nivel celular, el colageno IV interactúa con receptores de integrinas y DDR1 (discoidin domain receptor 1) ¹¹⁸.

iv) Colágenos que forman fibras de anclaje. El colágeno VII es el único miembro de esta familia y el componente mayoritario de las fibras de anclaje. Estas estructuras especializadas proporcionan una unión adicional entre la membrana basal y la matriz intersticial subyacente¹¹⁹. El colágeno VII ha sido mayoritariamente estudiado en la piel¹²⁰. Estructuralmente se trata de un homotrímero cuya cadena consiste en un segmento central de 145 kDa, que forma la triple hélice, un segmento NC1 (N-terminal) y un pequeño segmento NC2, C-terminal¹²¹. En el espacio extracelular, las triples hélices forman dímeros antiparalelos que interactúan con el cólageno tipo IV, la laminina 332¹²² y el colágeno I¹²³.

v) Colágenos en forma de collar de cuentas. Esta familia reúne a los colágenos VI, XXVI y XXVIII. El colágeno VI es una proteína fundamental de la matriz extracelular de tejidos musculares entre otros, y forma redes microfibrilares asociadas con la membrana basal. La unidad básica se compone de tres cadenas distintas: α-1 y α-2, ambas de 140kDa y α-3, de hasta 300kDa. Esta unidad se ensambla en tetrámeros en un proceso de varios pasos que comienza en el interior de la célula y termina en el espacio extracelular. Las microfibrillas formadas por los tetrámeros se anclan a diferentes moléculas que incluyen otros componentes de la MEC como el colágeno IV y el biglicano, o receptores de adhesión celular como las integrinas^124,125. Así, el colágeno VI promueve la estabilidad de la membrana sarcolémica durante la contracción muscular¹²⁶,  interviene en el ensamblaje de la membrana basal y controla eventos de señalización celular tales como la supervivencia celular y la regulación del tamaño de las miofibras¹²⁵.

vi) Multiplexinas. Los colágenos XV y XVIII son proteoglicanos estructuralmente homólogos caracterizados por la presencia de una triple hélice central interrumpida y flanqueada por regiones NC. Los dominios de interrupción aportan flexibilidad entre regiones en triple hélice y permiten la formación de polímeros estructuralmente diferentes a aquellos formados por los colágenos fibrilares⁶². El colágeno XVIII está unido a GAGs HS, mientras que el XV aparece unido a CS¹²⁷. En el corazón, el colágeno XV es más abundante que el XVIII, pero ambos son ubicuos y aparecen en membranas basales de diferentes tejidos¹²⁸. Aunque también se encuentran en otros colágenos, las multiplexinas poseen en sus dominios NC1, regiones con actividad independiente de su pertenencia a la molécula completa de colágeno. La restina y la endostatina (fragmentos proteolíticos derivados de los colágenos XV y XVIII, respectivamente), pueden ser liberadas por acción proteolítica y unirse a diversas moléculas de la matriz extracelular y la superficie celular ejerciendo importantes efectos sobre la adhesión y la migración celular¹²⁹ o la angiogénesis¹³⁰.

vi) MACITs: colágenos asociados a membrana con interrupciones en la triple hélice. Los colágenos XIII, XXIII y XXV son proteínas transmembrana de tipo II que contienen un corto dominio N-terminal citosólico y un largo domino C-terminal extracelular con estructura de triple hélice interrumpida, diana de diversas proteasas. Esta familia de colágenos posee propiedades de adhesión y su número de miembros identificados continúa en aumento¹³¹.

2.3. Glicoproteínas

La glicosilación es la unión covalente de moléculas de carbohidratos a la superficie de las proteínas. Se trata de la modificación postraduccional más prevalente y estructuralmente compleja¹³⁶. Desde un punto de vista estructural existen dos tipos de glicoproteínas: las N-glicosiladas, en las que el azúcar se une al nitrógeno amida de la asparragina¹³⁷, y las O-glicosiladas, en las que el enlace se produce a través oxígeno hidroxilo de la hidroxilisina, hidroxiprolina, serina o treonina¹³⁸. Numerosos estudios han demostrado que la glicosilación natural incrementa la estabilidad molecular de las proteínas¹³⁹. En la MEC, muchas glicoproteínas tienen papeles fundamentales en la estructura y adhesión de la membrana basal¹⁴⁰ o como moléculas reguladoras de diversos procesos^141,142.

a) Glicoproteínas mediadoras de la adhesión celular

Debido a la presencia de dominios especializados y residuos de carbohidratos, las glicoproteínas resultan componentes fundamentales para la adhesión celular, mediando el anclaje de las células a la membrana basal. Las lamininas¹⁴³ y la fibronectina son las glicoproteínas mejor caracterizadas en esta función. Además, su presencia se extiende a una gran gama de tejidos¹⁴⁴.

Lamininas. Las lamininas son proteínas heterotriméricas compuestas por diferentes combinaciones de cadenas a, b y γ. Actualmente se conocen 5 cadenas-a diferentes, 4 b y 3 γ, así como diferentes variantes de splicing de las mismas¹⁴⁵. Una forma común de esta proteína, la laminina 332, estaría compuesta por una unidad a-3, una b-3 y una γ-2¹⁴⁶. Los diferentes trímeros tienen una distribución tejido-específica⁹⁷ y juegan un papel importante para la estructura de la MEC y el anclaje de las células a la membrana basal. Las lamininas con forma de cruz completa son capaces de polimerizar para dar estructuras supramoleculares en forma de red¹⁴⁷ que constituyen un componente básico de las membranas basales. La incorporación de moléculas de laminina a la MEC está mediada por interacciones con otras proteínas tales como colágeno IV, nidógeno, fibulina y otras lamininas⁹⁷. 

Fibronectina. De modo natural, la fibronectina está presente en forma de dímero en el plasma sanguíneo a concentraciones micromolares. Cada subunidad está constituida por un mosaico de módulos repetidos de tipo I (12), tipo II (2) y tipo III (15-17), y una región variable no homóloga a otras partes de la fibronectina. Al contrario que la laminina, la fibronectina no polimeriza en condiciones fisiológicas normales y su presencia es reducida en la membrana basal, puesto que no existe una acumulación pasiva relevante y ésta se restringe a zonas especializadas de la superficie celular¹⁴⁸. Sin embargo, durante el desarrollo embrionario o situaciones de daño tisular (p.e. infarto de miocardio o hipertensión), su expresión se ve incrementada y además el tejido recluta fibronectina circulante. La fibronectina interviene entonces en la comunicación célula-MEC y la migración celular a través de su interacción con integrinas y otros receptores transmembrana¹⁴⁹.

b) Glicoproteínas matricelulares

Las proteínas matricelulares son un grupo heterogéneo de proteínas que interaccionan con receptotes celulares de superficie, la MEC, factores de crecimiento y proteasas, pero no funcionan como proteínas estructurales per se¹⁵⁰. Por ejemplo, la  trombospondina 1, SPARC o tenascina C son capaces de interrumpir interacciones célula-matriz que intervienen como componentes críticos en procesos tales como el remodelado tisular y la angiogénesis^151,152 . Debido a la diversidad molecular y funcional de este grupo de proteínas, resulta inadecuado elegir un modelo arquetípico o centrarse en algún ejemplo concreto dentro de esta clase. De este modo, aquellas proteínas que resultasen de interés una vez llevados a cabo los experimentos, serán tratadas de modo más detallado en la discusión de este trabajo.

2.4 Proteínas de membrana mediadoras de la interacción célula-MEC

La función de las proteínas del espacio extracelular no puede ser entendida sin tener en cuenta su interacción con el componente celular del tejido. Diversas proteínas resultan fundamentales en el establecimiento de esta comunicación. A continuación, se tratarán brevemente los aspectos básicos de estas.

 Integrinas. Estos receptores son heterodímeros transmembrana compuestos de subunidades α y β, con un largo  dominio extracelular y un pequeño dominio intracelular altamente conservado¹⁵³. El dominio extracelular interactúa con diversos componentes de la MEC¹⁵⁴ y el dominio intracelular lo hace tanto con moléculas de señalización celular como con componentes del citoesqueleto. En mamíferos existen 24 pares (αβ) de receptores diferentes que pueden solaparse en el reconocimiento de ligandos¹⁵⁵. Los cardiofibroblastos expresan mayoritariamente el par α₅β₁, que reconoce fibronectina y osteopontina, y los pares α_Vβ₁, α₅β₃ y α₅β₃, que unen adicionalmente vitronectina¹⁵⁶. Los cardiomiocitos adultos expresan el dímero α₇β₁, receptor de laminina¹⁵⁷. Sin embargo, aunque cada tipo celular posee una firma particular de integrinas, esta cambia rápida y dinámicamente una vez las células son extraídas de su entorno normal¹⁵⁸. En general, se puede decir que las integrinas constituyen el principal enlace entre la MEC y el citoesqueleto¹⁵⁹, e integran a ambos no sólo a nivel mecánico, sino como elemento activo de la señalización celular¹⁵⁸.

Sindecanos. Los sindecanos son una familia de proteoglicanos con núcleos proteicos transmembrana. Poseen un corto domino citoplasmático y un dominio extracelular con residuos de anclaje para HS y CS, que permiten la interacción con un amplio número de factores de crecimiento y proteínas de la MEC^160,161. En cardiofibroblastos, el reconocimiento de fibronectina por el sindecano-4 es necesario para una apropiada migración celular¹⁶² y el sindecano-1 contribuye a la fibrosis cardiaca inducida por angiotensina II¹⁶³.

Distroglicanos. Los distroglicanos α y β son los productos de un mismo transcrito que tras su traducción sufre acción proteolítica. El α-distroglicano (68kDa) se localiza en el espacio pericelular unido de forma no covalente al β-distroglicano (27 kDa), una pequeña proteína transmembrana¹⁶⁴. El α-distroglicano está altamente glicosilado y mediante su unión a lamininas, agrina y perlecano contribuye de modo importante a la interacción célula-MEC¹⁶⁵ .

CD44/epicano. El epicano es una glicoproteína transmembrana codificada por un gen único aunque expresada en diferentes formas por medio de splicing alternativo y diferentes modificaciones prostraducionales¹⁶⁶. Su largo dominio extracelular presenta un dominio de interacción con ácido hialurónico¹⁶⁷, aunque se ha demostrado la interacción de CD44 con otros GAGs y diferentes proteinas de la MEC¹⁶⁸ y metaloproteinasas de matriz (MMPs)¹⁶⁹, soportando la noción de que este receptor de membrana posee un papel importante en la señalización célula-MEC¹⁷⁰ .

DDRs. Las proteínas DDR (discoidin domain receptors) son receptores tirosina-kinasa importantes en la interacción célula-MEC. DDR2 en concreto, está considerado un marcador para determinadas poblaciones de fibroblastos cardiacos y es un receptor de colágenos fibrilares que media la migración y la proliferación de fibroblastos¹⁷¹.

3. Homeostasis de la MEC cardiaca: Las metaloproteasas de matriz

El remodelado lento y moderado de la MEC es característico del tejido cardiaco sano: la síntesis y la degradación de matriz se encuentran en equilibrio dinámico. Como ya se ha visto, la base estructural de la MEC cardiaca es el colágeno I, que resulta extremadamente resistente a la acción proteolítica¹⁷², pero muchos otros componentes son también partes importantes de la composición de la MEC. El mantenimiento adecuado del equilibrio en la MEC está sujeto a la acción de varios grupos de enzimas proteolíticas que toman parte en la degradación de los diferentes componentes. Entre estas enzimas se encuentran ADAM (A disintegrin and metalloprotease domanin-containing protein), proteasas séricas (plasmina, elastasa derivada de neutrófilos, catepsina G etc), cisteín-proteasas (catepsinas B, L y S), aspartil-proteasas (catepsina D) y MMPs¹⁷³ .

Las MMPs resultan especialmente relevantes para el remodelado de la MEC cardiaca en condiciones sanas y patológicas. Se trata de una familia de más de 25 proteasas que utilizan zinc como cofactor. En general son sintetizadas como pro-MMPs inactivas en las que el dominio catalítico permanece inaccesible debido a la interacción del propéptido N-terminal con el Zn⁺². Una vez el propéptido es liberado por acción proteolítica, el centro catalítico queda expuesto y la enzima activada¹⁷⁴. Tras ser secretadas, las pro-MMPs se unen a diversas moléculas de la MEC y permanecen en estado latente, constituyendo un reservorio que puede ser activado de modo inmediato ante una eventual demanda de actividad proteolítica en el tejido¹⁷⁵.

Las MMPs identificadas hasta el momento en el miocardio pertenecen a cuatro familias^175,176 y son sintetizadas por todos los tipos celulares mayoritarios del miocardio. En conjunto, pueden degradar la práctica totalidad de proteínas presentes en la MEC¹⁷⁵ y la relación de sustratos identificados permanece en constante aumento¹⁷⁷ (Tabla 1).

Tabla 1. MMPs identificadas en el corazón. Cuatro familias de MMPs están representadas en el tejido cardiaco, pudiendo degradar un enorme abanico de sustratos. Modificado de Somerville et al, 2003¹⁷⁸

Nombre	Código Uniprot	Sustratos
Colagenasas
Colagenasa intersticial	MMP1	Colágenos tipo I, II, III, VII, VIII, X, y gelatina. Agrecano, nidógeno, versicano, perlecano y tenascina-C.
Colagenasa 3	MMP13	Colágenos tipo I, II, III, IV, V, IX, X, XI, y gelatina. Agrecano, fibronectina, laminina, perlecano, tenascina, pro-MMP-9 y pro-MMP-13.
Colagenasa neutrófila	MMP8	Colágenos tipo I, II, III, V, VII, VIII, X, y gelatina. Agrecano, laminina, nidógeno y pro-MMP-8.
Gelatinasas
Gelatinasa A	MMP2	Colágenos tipo I, IV, V, VII, X, XI, XIV, y gelatina. Agrecano, elastina, fibronectina, laminina, nidógeno, versicano. MMP-9, MMP-13.
Gelatinasa B	MMP9	Colágenos tipo IV, V, VII, X, XIV y gelatina. Fibronectina, laminina, nidógeno, versicano y TGF-β.
Estromelisinas
Estromelisina 1	MMP3	Colágenos tipo II, IV, IX, X, y gelatina. Agrecano, decorina, elastina, fibronectina, laminina, nidógeno, perlecano, versicano, pro-MMP-1, pro-MMP8 y pro-MMP-9.
Matrilisina	MMP7	Colágenos tipo I, II, III, V, IV y X. Agrecano, elastina, laminina, decorina, pro-MMP-2, pro-MMP-7, integrina β4 y sindecano.
MMPs de membrana
MT1-MPP	MMP14	Colágenos tipo I, II, III y gelatina. Agrecano, fibronectina, laminina, nidógeno, perlecano, tenascina, vitronectin, pro-MMP2, pro-MMP-13, varias integrinas y CD44.

 

La importancia de las MMPs va más allá de la degradación de proteínas de la MEC. Varias MMPs tienen dianas proteolíticas en citoquinas, péptidos bioactivos y factores de crecimiento, afectando a su vez a diversos procesos en el miocardio^179,180,181. Algunas MMPs tendrían incluso la capacidad de reconocer pro-MMPs e inducir su activación¹⁸².

Debido a la eficacia de estas enzimas degradando sus sustratos, el establecimiento de un estricto control de su actividad resulta fundamental. Las TIMPs (tissue inhibitors of matrix metaloproteases) son proteínas de bajo peso molecular que se unen ávidamente a MMPs inhibiendo su actividad. TIMP-4 es la forma con mayor expresión en el tejido cardiaco¹⁸³. Además de MMPs, las TIMP inhiben otras proteasas con importantes papeles sobre la MEC. TIMP-4 en concreto, reconoce las proteasas de la familia ADAM ADAM-17, -28 y -33, resaltando la importancia de las TIMPs en la regulación de los procesos de remodelado en la MEC¹⁸⁴. Como se verá más adelante, la actuación de las MMPs resulta importante para el desarrollo de diversas patologías cardiovasculares. El control de su activación, pero también de su transcripción, son procesos altamente regulados que dependen de diversas vías de activación y represión¹⁸⁵ en las que intervienen citoquinas, factores de crecimiento, péptidos bioactivos y estímulos físicos^186,187. En conjunto, todos ellos contribuyen de forma esencial al mantenimiento en la MEC de un entorno que permita el correcto desarrollo de los procesos que resultarán en una apropiada función cardiaca.