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Modelos animales de cardiopatia isquémica

Desenmascarar de forma detallada los procesos que subyacen a las distintas manifestaciones de fallo cardiaco requiere el uso de modelos simplificados. La interacción entre diferentes órganos, tejidos o tipos celulares es muy relevante y contribuye al mantenimiento de la homeostasis de forma natural. Un evento de isquemia miocárdica provocará en muchas ocasiones un descenso en la fracción de eyección, y las consecuencias a nivel metabólico se traducirán en respuestas hormonales y nerviosas que de nuevo afectarán al desarrollo de la enfermedad coronaria. El desarrollo de modelos celulares in vitro ha permitido el estudio de rutas específicas de forma aislada en cardiomiocitos237, cardiofibroblastos238 o células endoteliales239, desenmascarando procesos que no resultan abordables cuando estas células se encuentran en su medio natural. Sin embargo, la necesidad de estudiar procesos celulares en entornos fisiológicamente relevantes, limita el uso de estos modelos. Inversamente, el estudio de la patología isquémica del corazón a partir de muestras humanas está limitada por factores adicionales que interfieren en las conclusiones. Así, la edad, el sexo o el historial clínico resultan factores difíciles de bloquear en estudios en los que el tamaño muestral se ve limitado económica o logísticamente.

Mediante la inducción artificial de diferentes formas de patología cardiovascular, el uso de animales de experimentación permite el estudio de éstas sin interferencias asociadas a la presencia de otras enfermedades o estados fisiológicos.

1.     Modelos de inducción de cardiopatía isquémica

En un modelo animal, la patología inducida debe reproducir de forma fiel las características estructurales y funcionales de la patología humana, que en el caso de la cardiopatía isquémica será el estrechamiento crónico de una arteria coronaria por el depósito de placas de ateroma o la oclusión por trombosis240. Existen tres situaciones posibles derivadas de la disminución del diámetro arterial coronario.

(i)     Isquemia crónica. La oclusión es total y el flujo no se restaura.

(ii)    Hibernación miocárdica. La reducción de diámetro es parcial y, de forma prolongada o crónica, el miocardio ha de adaptar su metabolismo a un suministro deficiente de oxígeno y nutrientes.

(iii)   Isquemia/reperfusión o isquemia transitoria. La oclusión del vaso es total, pero el flujo es restaurado tras un período cuya duración determinará la afectación final del tejido.

Con esto en mente, uno de los modelos inicialmente considerados fue el de inducir la formación de placas de ateroma mediante dietas altas en grasas y colesterol. Esta estrategia se ha mostrado efectiva en varios modelos241,242. Sin embargo, el momento y el lugar de la coronaria en la cual ocurre la oclusión resulta aleatorio y por este motivo, si bien son modelos apropiados para el estudio de la evolución de la aterosclerosis, no resultan prácticos en experimentos dirigidos al estudio de efectos específicos derivados de esta, como las cardiopatías isquémicas. Adicionalmente, se ha demostrado el efecto cardioprotector de los estrógenos en diversos modelos de hipercolesterolemia243,244, por lo que el sexo es un factor adicional a tener en cuenta que complica aún más el desarrollo de un modelo de cardiopatía isquémica derivada de aterosclerosis.

Aunque obvia otros efectos asociados a la aterosclerosis, la inducción quirúrgica de oclusión o estrechamiento coronario, facilita enormemente la obtención de lesiones de localización y tamaño prefijados, que derivan en resultados más reproducibles. Además, el modelo de inducción quirúrgica tiene la ventaja de poder fijar tanto el nivel (total mediante oclusión o parcial mediante estrechamiento) como la duración de la isquemia (permanente o seguida de reperfusión). Ambos tienen ventajas y desventajas, y cada uno ha de ser valorado dependiendo de los objetivos del estudio. Así, el modelo de isquemia/reperfusión, presenta un mayor componente inflamatorio, menor fibrosis y facilita la neoangiogénesis en las primeras etapas tras la isquemia245. Por su parte, el modelo de oclusión crónica evita estos efectos, pero suele presentar mayores tasas de mortalidad246, además de no ajustarse a la realidad de la mayor parte de los casos clínicos, en donde la cirugía de reperfusión o los trombolíticos y anticoagulantes se utilizan como tratamiento de emergencia en eventos agudos de oclusión coronaria.

1.1 Sistemas quirúrgicos de inducción de isquemia o hibernación miocárdica crónicas

a.              Oclusor hidráulico y constrictor ameroide. Estos sistemas, se basan en la oclusión total o parcial de alguna rama arterial coronaria, se utilizan especialmente en animales de gran tamaño. Tras una incisión en el pericardio, la arteria es expuesta y a su alrededor se coloca un oclusor hidráulico que es inflado hasta obtener el grado de oclusión coronaria deseada (Figura 19A)247. Al utilizar un constrictor ameroide, el plástico de caseína que compone el dispositivo se hidrata a temperatura corporal, dilándose hasta obtener la constricción de la arteria (Figura 19B)248. Puesto que el grado de oclusión puede ser fijado, ambos sistemas son adecuados tanto para modelos de isquemia crónica como de hibernación miocárdica.

b.              Ligamiento coronario. Tras un procedimiento quirúrgico similar al anterior, la arteria es ligada utilizando hilo o tejido umbilical (Figura 19C). Este sistema es utilizado en modelos animales de tamaños muy diversos249 pero sólo es apropiado para la inducción de isquemia miocárdica permanente.

c.              Embolismo arterial coronario. La estrategia de oclusión por embolia coronaria (Figura 19D) se basa en la utilización de microesferas, agarosa, bolitas de poliestireno o la inyección intracoronaria de trombina y sangre autóloga con fibrinógeno para provocar una obstrucción coronaria250,251. Este procedimiento se lleva a cabo en animales grandes, y el efecto obtenido es de isquemia permanente. Presenta frente a las demás, la ventaja de ser una intervención percutánea, lo que reduce el riesgo de complicaciones por inflamación severa. Como desventaja evidente, aparece la dificultad de controlar de forma precisa la localización exacta de la oclusión.

1.2    Sistemas quirúrgicos de inducción de isquemia-reperfusión

a.   Oclusor hidráulico y constrictor ameroide. La duración de la oclusión es un aspecto crucial en modelos de isquemia-reperfusión. Un tiempo excesivo de isquemia puede rebasar el límite del entorpecimiento miocárdico y derivar en infarto de miocardio.

b.   Ligamiento coronario transitorio. Utiliza el mismo procedimiento que en el caso del ligamiento permanente. El nudo se mantiene cerrado durante el tiempo convenido y se retira al final de la operación. En este modelo, un pequeño tubo plástico se sitúa entre el cordón y el vaso, para minimizar el daño y permitir una mejor restauración del flujo coronario.

c.  Embolismo coronario transitorio. La necesidad de utilizar técnicas quirúrgicas altamente invasivas es una desventaja puesto que el riesgo de inflamación severa y otras complicaciones hacen que la tasa de supervivencia sea baja. En animales grandes, el embolismo transitorio de la arteria coronaria puede provocarse utilizando cateterismo arterial mediante un procedimiento similar al cateterismo de reperfusión practicado en pacientes con eventos agudos de isquemia coronaria. A partir de una vía femoral o radial se avanza un catéter provisto de un balón apical hasta la arteria coronaria, en donde se infla mediante un sistema hidráulico hasta provocar la embolia total del vaso (Figura 19E). Transcurrido el tiempo oportuno, se desinfla el balón y se retira el instrumental, suturándose la vía arterial252.

 

Figura 19. Sistemas quirúrgicos de inducción de isquemia miocárdica. Modificada de Klocke R. et al, 2007253.

 

 

1.3  Modelo de isquemia/reperfusión ex vivo.

En 1895, O. Langendorff desarrolló un sistema de perfusión cardiaca ex vivo. En él, el corazón del modelo seleccionado es extirpado y canulado, manteniéndose en condiciones fisiológicas de temperatura y pH254.  Este modelo ha sido utilizado con animales que van desde la rata255 al cerdo256  y permite estudiar el efecto de fármacos, citoquinas y otras sustancias sin interferencia de estímulos endógenos.

2. Modelos animales en la cardiopatía isquémica.

Diversos modelos animales han sido tenidos en cuenta en el estudio de la cardiopatía isquémica. Todos ellos presentan ventajas que los hacen valiosos o prácticos, y la selección del modelo apropiado debe tener en cuenta los objetivos particulares de cada estudio.

2.1 Modelos en animales no mamíferos.

a. Drosophila melanogaster. A pesar de la distancia filogenética que la separa de los mamíferos, la mosca de la fruta presenta características que la convierten en un modelo útil para el estudio de mecanismos moleculares asociados a la isquémica. Las rutas de señalización asociadas a hipoxia aparecen muy conservadas evolutivamente en D. melanogaster y el catálogo de cepas mutantes disponibles es exhaustivo. Obviamente, resulta un modelo extremadamente limitado cuando se trata de ir más allá de la regulación génica, pero ha sido enormemente útil en estudios que han desvelado por ejemplo, los mecanismos de tolerancia a la hipoxia257  o la regulación de la cardiomiogénesis258.

b. Danio renio: Su sistema cardiovascular cerrado, rápido desarrollo, transparencia corporal y la facilidad para establecer cepas genéticamente modificadas, hacen del pez cebra un modelo valioso en el estudio de cardiopatías. D. renio presenta la capacidad de regenerar, con poca o ninguna cicatriz, el tejido cardiaco aún cuando este es extirpado en un 20%. Tras infarto inducido por daño criogénico, el tejido cardiaco atraviesa las etapas de inflamación y fibrosis propias de mamíferos pero, a continuación, la matriz del tejido fibrótico es degradada, los cardiomiocitos proliferan e invaden la zona dañada hasta reestablecer la funcionalidad del tejido259,260. Frente a D. melanogaster, D. renio es no sólo susceptible de ser intervenido quirúrgicamente, sino que además resulta tremendamente tolerante a ello.

2.2 Modelos en mamíferos pequeños

Aunque han aportado datos muy relevantes acerca de la regulación génica de los procesos post-isquemia y el desarrollo cardiaco general, los modelos en animales no mamíferos encuentran barreras obvias relacionadas con la relevancia clínica de los resultados obtenidos. Muchas investigaciones se han centrado en modelos de mamíferos pequeños que presentan ciclos de cría cortos, requieren cuidados menores y sobre todo, permiten el uso extensivo de individuos transgénicos.

a. Roedores: Los roedores de laboratorio como ratas y ratones presentan la ventaja de ser baratos, homogéneos y fáciles de criar y modificar genéticamente, mientras que su uso está expuesto a poco debate ético. Estas características facilitan a su vez la utilización de tamaños muestrales grandes. Su uso extensivo ha provocado también el desarrollo de equipamiento clínico adaptado que permite una evaluación precisa de parámetros como la función cardiaca o las tallas de infarto. Sin embargo, existen diferencias fisiológicas importantes entre estos modelos y los humanos261. El ratón tiene una masa corporal 3000-4000 veces inferior a un adulto medio, presenta una frecuencia cardiaca en reposo 5 veces superior y su tasa metabólica es entre 10 y 15 veces más alta. El potencial de acción de los cardiomiocitos de ratas y ratones se caracteriza por ser muy corto y carecer de la fase de meseta isoeléctrica262. La expresión de isoformas de la miosina difiere entre roedores y humanos263,264 y, aunque la retirada del Ca+2 citosólico ocurre gracias a la actividad de Serca2 en roedores y humanos, el intercambio Na+/Ca+2 resulta menos relevante en los roedores265.

b. Conejos: Modelos en conejos hiperlipidémicos  han sido utilizados en diversos estudios de infarto de miocardio espontáneo inducido por acumulación de placas intracoronarias, comprobándose que la incidencia de infarto es superior al 90%. En este modelo, desafortunadamente, el tiempo de desarrollo medio es de 11 meses, y además las placas no se rompen de un modo equivalente al humano266. Igual que en los roedores, otras diferencias a nivel celular, hacen del conejo un modelo bastante limitado para el estudio de la cardiopatía isquémica264.

 

 

 

 

2.3 Modelos en mamíferos grandes

Aunque los modelos en mamíferos pequeños son apropiados para el estudio de procesos a nivel molecular, diversos estudios muestran que las conclusiones obtenidas no son siempre extrapolables a animales de mayor tamaño267. El corazón de animales más grandes es más similar al humano a nivel anatómico y fisiológico y por tanto, en ocasiones resulta recomendable escalar a modelos que reproduzcan de manera más fiel la patología humana.

a.  Modelos en primates no humanos. Debido a que los primates no humanos presentan mayores similitudes con el hombre que cualquier otro mamífero, resulta tentador pensar que serían los mejores candidatos como modelo en enfermedades cardiovasculares, pero esta idea resulta equivocada. En primer lugar, el uso de primates no humanos suscita enormes críticas en pro de los derechos de los animales, y en particular de un grupo de animales con una enorme similitud genética con el hombre. Cabe destacar además que diversas especies de primates aparecen incluidas en la lista de especies en peligro de extinción. Además, existen enormes dificultades logísticas inherentes al trabajo con este tipo de animales. Su adquisición y mantenimiento resultan extremadamente caros y además albergan enfermedades potencial o altamente infecciosas para el hombre, y pueden a su vez ser infectados por el hombre. Aun salvando este tipo de consideraciones, los primates no humanos presentan importantes diferencias anatómicas y fisiológicas con el hombre. El corazón de muchos primates es muy pequeño y por tanto posee un menor número de células cardiacas y una distribución diferente. Estos  primates, presentan además ritmos cardiacos muy rápidos que pueden llegar a los 200 latidos por minuto en reposo268. Finalmente, aun obviando los obstáculos mencionados, no existen evidencias de que los datos fisiológicos a nivel cardiovascular obtenidos en monos hayan aportado datos adicionales a los ya obtenidos a partir de mamíferos no primates.

b.  Modelos caninos. Históricamente, el modelo canino ha sido ampliamente utilizado en el estudio de la isquemia cardiaca y el infarto de miocardio. Así, Reimer et al. llevaron a cabo en 1979 un estudio orientado a describir de forma precisa la evolución temporal de la lesión en relación con los tiempos de isquemia269. Otros estudios han utilizado modelos caninos de isquemia-reperfusión para evaluar el remodelado ventrícular y su relación con el sistema renina-angiotensina270,271, o el efecto de la inyección de células madre sobre la función cardiaca272. Sin embargo, el sistema vascular coronario del perro se caracteriza por la presencia de una circulación colateral significativa273,274 que ejerce un efecto protector  sobre el daño por isquemia y altera el desarrollo de los procesos post-isquémicos, haciendo que el tamaño de los infartos inducidos sea muy impredecible275. Esto ha hecho trasladar paulatinamente las investigaciones hacia modelos alternativos.

c.  Modelo ovino. En modelos en ovejas y cerdos, la anatomía coronaria y la ausencia de vasos colaterales preformados, hacen factible inducir infartos de tamaño y ubicación previsibles que resultan adecuados para el estudio del remodelado ventricular post-isquémico274,276. El modelo ovino ha sido empleado para estudios relativos a la expansión temprana del infarto y la zona adyacente a éste, demostrando que las regiones adyacentes se extienden hacia zonas contiguas de tejido sano, implicándolas en el proceso de remodelado277. Sin embargo, como rumiantes domésticos, las ovejas presentan una anatomía gastrointestinal y un contorno torácico que dificulta la obtención de imágenes ecográficas y hace recomendable un enfoque invasivo276,277.

d.  Modelo porcino. Como el hombre, el cerdo es un animal omnívoro. Su tasa metabólica, relación masa corporal/masa del corazón y ritmo cardiaco son comparables, y la presión sanguínea es sólo ligeramente superior278. El corazón del cerdo presenta una anatomía gruesa muy similar a los humanos y ha sido confirmado en trabajos de diversos autores como un modelo muy adecuado para el estudio de la fisiopatología de la cardiopatía isquémica279,280, pero también estudios centrados en la cardiopatía dilatada281 o terapia celular272 avalan la validez de este modelo en el campo cardiovascular. Debido a las similitudes encontradas entre los corazones de ambas especies, el cerdo ha sido utilizado incluso como donante en alguna de las escasas experiencias de xenotrasplante cardiaco282, y las válvulas cardiacas se utilizan actualmente como xenoinjertos en la práctica clínica283.

Las limitaciones principales del uso de este modelo animal tienen que ver con una cierta predisposición al desarrollo de arritmogénesis en modelos de cardiopatía isquémica que, de todos modos, se supera mediante la administración de suplementos con electrolitos y agentes anti-arritmogénicos en modelos poco invasivos284. La limitación representada hasta hace poco por la carencia de bases de datos y catálogos completos para el cerdo a nivel genómico y proteómico aparece cada vez más reducida con la secuenciación del genoma porcino285,286 y el aumento del número de anticuerpos disponibles que reconocen moléculas porcinas.

Anatomía del corazón porcino comparada con la humana. A pesar de las similitudes entre el corazón humano y porcino, existen todavía diferencias anatómicas que, sin embargo, pueden ser explicadas es su mayor parte por la diferente posición corporal de las dos especies (unguligrado/cuadrúpedo frente a ortógrado/bípedo) (Figura 20A). Este factor ha ejercido un efecto determinante a nivel evolutivo haciendo que las dos especies hayan tenido que adaptarse de maneras diferentes a la gravedad. Junto con el hombre, solamente los restantes mamíferos bípedos, tales como los primates y los canguros,  habrían adaptado su sistema cardiovascular a una postura ortógrada287. Algunas de las diferencias pueden ser también explicadas por la forma lateralmente comprimida del tórax porcino cuando se compara con el humano. Como consecuencia de todo ello, el corazón porcino se encuentra suspendido por sus vasos mayores en la cavidad torácica, con su cara anterior descansando cerca del esternón y la mayoría de la superficie posterior adyacente al diafragma288.

Aurículas. Las aurículas derecha e izquierda del corazón porcino son de tamaño similar, al contrario que en el hombre, en donde la aurícula derecha, y particularmente su orejuela, es apreciablemente mayor que la izquierda. La aurícula izquierda recibe dos venas pulmonares en el cerdo, mientras en humanos aparecen generalmente cuatro orificios de entrada para las venas pulmonares. En el cerdo, las venas cavas superior e inferior entran en la aurícula derecha formando un ángulo recto entre ellas. En el hombre se disponen formando un ángulo de 180 grados288 .

Ventriculos.  La pared ventricular izquierda del cerdo adulto es mucho más gruesa que la de corazones humanos de la misma talla. Mientras que el ápex del corazón humano se sitúa entre ambos ventrículos, en el cerdo el ápex está compuesto totalmente por musculatura del ventrículo izquierdo (Figura 20A,B). Como consecuencia de la diferente postura, los vasos de entrada y salida aparecen directamente alineados en el cerdo, mientras que en el hombre aparecen dispuestos casi perpendicularmente288.

Circulación coronaria. Igual que en humanos, el corazón porcino presenta dos ramas arteriales que derivan en tres arterias coronarias principales. La primera rama, o arteria coronaria izquierda derivará en la arteria coronaria izquierda descendente anterior, que transcurre a lo largo del surco interventricular anterior, y la arteria circunfleja, que lo hace a través del surco auriculoventricular. La segunda rama, o arteria coronaria derecha, derivará en la arteria coronaria descendente posterior, que transcurre a lo largo del surco interventricular posterior, y la marginal derecha, que irriga el ventrículo derecho. La dominancia coronaria es generalmente diestra tanto en el cerdo288 como en humanos, siendo la coronaria derecha la que surte a la descendente posterior. La evaluación cuantitativa de la anatomía y distribución de las arterias coronarias en el cerdo ha demostrado una presencia reducida de circulación colateral, que se restringe de forma dispersa a zonas del  miocardio medio y el subendocardio274. Por su parte, el sistema venoso coronario porcino se caracteriza principalmente por carecer de una vena ácigos derecha, que en humanos y otros mamíferos desemboca en la vena cava superior derecha. Por el contrario, una prominente vena ácigos izquierda, vestigial en humanos289, drena el seno coronario.

Tejido de Purkinje. Si bien la anatomía gruesa y la fisiología del corazón porcino y el humano son ampliamente comparables, las mayores diferencias entre ambas especies se encuentran a nivel de las  fibras de Purkinje. El tejido de Purkinje es una extensión cardiaca del sistema nervioso autónomo que en humanos se extiende por las paredes ventriculares internas, justo por debajo del endocardio. Su función es la de conducir el estímulo eléctrico y orquestar la contracción cardiaca3. Su distribución en el corazón porcino es diferente de aquella encontrada en primates y carnívoros y el origen de esta diferencia ha de buscarse en el origen evolutivo de estas especies. El cerdo ha evolucionado a partir de ancestros de gran talla, que poseían corazones enormes. La velocidad de propagación de la despolarización de las fibras miocárdicas (unos 0,4 m/s) es aproximadamente igual en los diferentes mamíferos. En mamíferos pequeños es suficiente con que el tejido de Purkinje se distribuya simplemente por debajo del endocardio para coordinar la contracción de todo el miocardio. Sin embargo, en  animales grandes, la onda de despolarización tardaría tanto en llegar al otro lado de la pared ventricular, que la asincronía comprometería seriamente la eficiencia de la contracción cardiaca. Por ese motivo las fibras de Purkinje han de penetrar en la práctica totalidad del grosor del miocardio290.

Figura 20.  El corazón porcino. A) Comparación anatómica entre un corazón humano y un corazón porcino. Las diferencias de mayor relevancia, expuesta en el texto, aparecen enmarcadas en el esquema del corazón porcino. Fernández-Caggiano M. B) Vista interna detallada de un corazón porcino291.

 

 

3. Consideraciones éticas referentes al uso de animales de experimentación.

Cada año, más de 75 millones de vertebrados se utilizan en todo el mundo con fines experimentales292, siendo ratones y ratas las especies preferidas. Diversos documentos a nivel nacional y europeo regulan la actividad de investigaciones que requieren animales (Real Decreto 1201/2005 y Directiva 2010/63/UE, respectivamente). De modo general se establece que aquellos experimentos que utilicen animales han de ser diseñados bajo el “Principio de las tres R”. 1) Sustitución (del inglés replacement) de los animales vivos por modelos in vitro o  computerizados. 2) Reducción del número de animales utilizados para los experimentos. Para ello, es necesario un diseño que utilice animales estandardizados para reducir la variabilidad y realizar estimaciones previas de potencia estadística. 3) Refinamiento, significa proporcionar el máximo confort trasladando a los animalarios soluciones que, en la medida de lo posible, cubran las necesidades etológicas y fisiológicas de los animales, evitando además el sufrimiento innecesario mediante la utilización de anestesias  y cuidados adecuados293. El uso de animales de experimentación debe ser, en resumen, considerado cuando no exista otra alternativa viable. Es necesario tener en cuenta que el desconfort y el estrés durante los experimentos, así como un diseño experimental no razonable, resultan una violación de los derechos de los animales, pero además llevarán inevitablemente a la obtención de efectos no específicos que desvirtuarán los resultados293.

 

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